采用Venusil MP C₁₈（100 mm×2.1 mm，3 μm）为色谱柱；采用乙腈（A）和0.1%甲酸溶液（B）为流动相进行梯度洗脱（0～3.0 min，10%A；3.0～18.0 min，10%A→50%A；18.0～21.0 min，50%A→85%A；21.0～22.0 min，85%A；22.0～22.1 min，85%A→10%A；22.1～25.0 min，10%A）；流速为0.30 mL/min；柱温为40 ℃；进样量为5 μL。

采用电喷雾离子源正离子模式进行扫描；检测方式为多重反应监测；气帘气为30 L/min；GS1雾化气为50 L/min，GS2辅助加热气为50 L/min；CAD碰撞气为Medium；辅助加热气温度为500 ℃；喷雾电压为5 500 V。6个成分的质谱条件见表2，对照品及样品的多反应监测（multi-reaction monitoring，MRM）色谱图见图1。

表2  青黛中6个成分的质谱参数

成分	tR/min	母离子m/z	子离子m/z	解簇电压/V	碰撞能量/V
靛蓝	15.98	262.9	219.0	91	33
靛玉红	17.39	262.9	190.1	91	48
靛红	4.81	148.0	102.1	80	24
色胺酮	14.07	248.9	130.2	80	38
吲哚	7.55	117.9	91.2	103	28
吲哚-3-甲醛	7.55	145.9	118.1	80	18

Download:  CSV Download:  Table Images

图1  6个成分对照品（A）和青黛供试品（B）的MRM色谱图

Download:  Full-size image | High-res image | Low-res image

取靛蓝、靛玉红、靛红、色胺酮、吲哚、吲哚-3-甲醛对照品适量，精密称定，加入2%水合氯醛的三氯甲烷溶液（取硅胶干燥器中放置24 h的水合氯醛，称取2.0 g，加三氯甲烷至100 mL，放置，出现浑浊，以无水硫酸钠脱水，滤过，即得^[

取青黛样品约20 mg，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入2%水合氯醛的三氯甲烷溶液100 mL，称定质量。超声（功率300 W，频率25 kHz）提取90 min，取出，放冷，用2%水合氯醛的三氯甲烷溶液补足减失的质量，摇匀，取上清液，用0.22 μm的微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

取“2.2.1”项下的混合对照品溶液，用2%水合氯醛的三氯甲烷溶液逐级稀释为系列浓度的混合对照品溶液，按“2.1”项下条件分析。以各成分的质量浓度为横坐标（X），定量离子的峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线。结果显示，各成分的质量浓度与其峰面积有良好的线性关系。用2%水合氯醛的三氯甲烷溶液稀释混合对照品溶液一定倍数后，进行测定。以信噪比3∶1和10∶1时对应的最低质量浓度分别确定各成分的检测限、定量限，结果见表3。

表3  青黛中6个成分的回归方程、线性范围、检测限及定量限的结果

成分	回归方程	线性范围/（ng/mL）	r	检测限/（ng/mL）	定量限/（ng/mL）
靛蓝	Y＝5 261.32X+2 536 057.47	146.70～9 390.00	0.998 6	2.115	6.346
靛玉红	Y＝8 173.21X+111 339.66	13.97～894.00	0.999 5	1.238	3.715
靛红	Y＝5 106.63X+32 021.72	7.06～451.50	0.999 1	0.468	1.403
色胺酮	Y＝405 869.68X+75 701.15	0.45～28.90	0.999 8	0.072	0.217
吲哚	Y＝23 139.58X+1 189.31	0.44～28.10	0.999 9	0.079	0.236
吲哚-3-甲醛	Y＝41 272.07X+7 936.38	0.21～13.15	0.999 6	0.033	0.100

Download:  CSV Download:  Table Images

取“2.2.1”项下的混合对照品溶液，稀释一定倍数以后，按“2.1”项下条件连续进样6次进行分析，记录峰面积，计算RSD。结果显示，靛蓝、靛玉红、靛红、色胺酮、吲哚、吲哚-3-甲醛峰面积的RSD分别为1.87%、1.34%、3.83%、1.08%、3.27%、3.10%（n＝6），表明仪器的精密度良好。

按照“2.2.2”项下方法制备S2青黛样品供试品溶液6份，按照“2.1”项下条件进样分析，计算各成分的含量。结果显示，靛蓝、靛玉红、靛红、色胺酮、吲哚、吲哚-3-甲醛的平均含量分别为25 475.01、2 512.91、343.12、3.42、4.19、3.04 μg/g（n＝6），含量的RSD分别1.92%、2.20%、2.17%、1.68%、3.81%、3.91%（n＝6），表明方法的重复性良好。

取同一供试品溶液，分别于0、4、8、12、24 h时按照“2.1”项下条件进样分析，记录峰面积，计算RSD。结果显示，靛蓝、靛玉红、靛红、色胺酮、吲哚、吲哚-3-甲醛峰面积的RSD分别为2.03%、1.19%、2.93%、0.82%、3.41%、3.24%（n＝5），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

取S2青黛样品的粉末6份，每份10 mg，精密称定。分别精密加入6个吲哚生物碱对照品储备液适量。按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下条件进样分析，记录峰面积，计算各成分的加样回收率及RSD。结果显示，靛蓝、靛玉红、靛红、色胺酮、吲哚、吲哚-3-甲醛的平均加样回收率分别为96.81%、95.03%、94.48%、90.49%、90.71%、92.30%（n＝6），RSD分别为2.00%、1.20%、3.15%、3.20%、4.02%、3.09%（n＝6），表明方法准确度良好。

采用SPSS 21.0软件，以6个成分的含量为变量进行聚类分析，结果见图2。从图2可知，当平方欧氏距离为10时，12批青黛药材可以聚为2类，S1、S2、S4、S6、S7、S9、S10号样品聚为Ⅰ类，S3、S5、S8、S11、S12号样品聚为Ⅱ类。在Ⅰ类样品中，S1、S2、S9、S10号样品产自四川，S4、S6号样品产自福建，S7号样品产自贵州；Ⅱ类样品中，S3号样品产自四川，S5、S8、S11、S12号样品产自福建。

图2  不同产地青黛聚类分析树状图

Download:  Full-size image | High-res image | Low-res image

采用SPSS 21.0软件对12批青黛药材6个成分进行主成分分析，对6个成分含量测定数据进行标准化处理以后，计算初始特征值，累计方差贡献及主成分综合得分，前3个主成分累计贡献率为85.225%，可以解释大部分信息。主成分1中符号为正且特征向量载荷较高的为吲哚、吲哚3-甲醛、靛蓝、靛玉红；主成分2中符号为正且特征向量载荷较高的为靛蓝、靛玉红、靛红；主成分3中符号为正且特征向量载荷较高的为色胺酮与靛玉红。用3个主成分的综合得分作为评价指标对不同产地的青黛药材进行综合评价，Ⅰ类样品得分较高，质量较优，Ⅱ类样品得分较低，质量较差，结果见表5。

表5  不同产地青黛各主成分得分、综合得分及排名

样品编号	主成分1得分	主成分2得分	主成分3得分	主成分综合得分	排名
S1	－0.62	0.78	－1.68	－0.48	7
S2	1.30	0.71	0.53	0.99	3
S3	1.17	－1.97	－1.19	－0.13	6
S4	2.23	0.91	－0.17	1.39	1
S5	－0.03	－2.63	0.69	－0.56	9
S6	1.23	－0.04	－0.37	0.57	5
S7	0.96	0.18	1.47	0.86	4
S8	－2.93	0.46	0.75	－1.29	12
S9	－0.71	0.71	－1.56	－0.51	8
S10	1.41	1.00	0.96	1.21	2
S11	－2.20	0.26	0.46	－1.01	10
S12	－1.81	－0.36	0.10	－1.04	11

Download:  CSV Download:  Table Images

将各样品6种成分含量测定数据导入SIMCA14.1软件进行偏最小二乘法-判别分析，进一步比较不同产地青黛的质量，寻找差异性成分，结果见图3。由图3可知，S1、S2、S4、S6、S7、S9、S10号样品分为Ⅰ类，S3、S5、S8、S11、S12号样品分为Ⅱ类，与聚类分析结果一致。根据变量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）值＞1的原则筛选不同产地青黛的差异成分，靛蓝、靛玉红、色胺酮、靛红的VIP值大于1（VIP值分别为1.005 6、1.003 0、1.002 9、1.001 7），说明这4个成分是造成2类样品质量差异的主要物质。吲哚、吲哚-3-甲醛的VIP值大于0.95（VIP值分别为0.987 6、0.982 1），这2个成分对分类结果也有一定影响。结果见图4。

图3  12批青黛样品基于6个成分的偏最小二乘法-判别分析图

Download:  Full-size image | High-res image | Low-res image

图4  6个成分的偏最小二乘法-判别分析VIP得分图

Download:  Full-size image | High-res image | Low-res image