夏枯草为唇形科植物夏枯草Prunella vulgaris L.的干燥果穗，以其夏季果穗呈棕红色时采收，除去杂质，晒干入药，该药材性寒、味辛、苦，归肝、胆经，具有清肝明目、消肿散结的功效[1]，临床常用于治疗甲状腺肿大、淋巴结核、乳腺增生、肺结核、急性黄疸型传染性肝炎、高血压等症[2－3]。夏枯草现收载于2020年版《中国药典》（一部），以迷迭香酸为指标成分[1]。现代研究表明，夏枯草主要含有黄酮类、酚酸类、三萜类、甾体类等化合物，具有降血压、降血糖、抗菌、抗病毒、抗炎和抗肿瘤等活性[3－4]。其中黄酮类化合物为夏枯草的主要活性成分之一，具有抗氧化、抗菌、抗肿瘤、调节免疫及保护心血管等药理作用[5]，与夏枯草药理作用有较大关联性。目前夏枯草的质量研究主要为传统生药学鉴别[6]、指纹图谱[7]等，但传统生药学鉴别的主观影响较大，干扰因素较多；指纹图谱只能从化学成分方面进行考察，无法全面、综合地评价夏枯草质量。基于此，本研究以10个产地的117批夏枯草饮片为研究对象，以迷迭香酸、水分、水溶性浸出物及总黄酮含量为评价指标，采用熵权法计算权重，同时结合灰色关联度分析法计算关联度，旨在为全面、客观评价夏枯草的质量提供参考。1材料1.1主要仪器本研究所用主要仪器有1120型高效液相色谱仪、BIY211b型电子天平、AY120型十万分之一天平（日本Shimadzu公司），LK-400型手提式高速中药粉碎机（温岭市创力药材器械厂），KQ-500DE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），UV-1800 型紫外分光光度计（北京北分瑞利分析仪器公司），SHB-Ⅲ型循环式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）。1.2主要药品与试剂迷迭香酸对照品（批号14020115，纯度≥98%）、芦丁对照品（批号12040302，纯度≥98%）均购自成都曼思特生物科技有限公司；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为双蒸水。117批夏枯草饮片于2019年6月购自江苏南京、安徽亳州、河南新乡等10个产地，经广东药科大学中药学院姬生国教授鉴定为唇形科植物夏枯草P. vulgaris L.的干燥果穗。样品经干燥后粉碎，过24 目筛，保存于自封袋中，置于干燥器中备用。夏枯草饮片的信息来源见表1。10.6039/j.issn.1001-0408.2022.24.10.T001表1夏枯草饮片的信息来源编号产地编号产地S1～S15江苏省淮安市S54～S62河南省南阳市S16～S25江苏省南京市S63～S88安徽省亳州市S26～S33河南省洛阳市S89～S97湖北省随州市S34～S45河南省驻马店市S98～S111湖北省咸宁市S46～S53河南省新乡市S112～S117广西壮族自治区南宁市2方法与结果2.1迷迭香酸的含量测定2.1.1色谱条件以ODS-C18（250 mm×4.6 mm，5 µm）为色谱柱，以甲醇-0.1%三氟乙酸溶液（42∶58，V/V）为流动相；流速为0.6 mL/min；柱温为30 ℃；检测波长为330 nm；进样量为5 µL。2.1.2对照品溶液的制备取迷迭香酸对照品5.09 mg，精密称定，置于10 mL容量瓶中，加稀乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成迷迭香酸质量浓度为0.509 0 mg/mL的对照品溶液。2.1.3供试品溶液的制备取样品0.25 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇25 mL，超声（功率90 W，频率59 kHz）处理30 min，放冷，再次称定质量，用稀乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。2.1.4系统适用性试验取上述对照品溶液、供试品溶液及空白溶液（稀乙醇），按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图（图1，空白图略）。结果显示，迷迭香酸峰形稳定，与供试品中的其他色谱峰达到基线分离，理论板数为17 718。10.6039/j.issn.1001-0408.2022.24.10.F001图1供试品溶液、迷迭香酸对照品溶液的HPLC图2.1.5线性关系考察取“2.1.2”项下对照品溶液1.0、1.0、1.0、2.0、1.0、1.0、1.0 mL，分别置于2、5、10、25、25、50、100 mL容量瓶中，用稀乙醇定容，摇匀，得系列线性溶液。取上述系列线性溶液及对照品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以质量浓度为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归。结果显示，迷迭香酸的回归方程为 Y＝2×107X－65 910（r＝0.999 9），表明迷迭香酸的检测质量浓度在0.005 09～0.509 0 mg/mL范围内线性关系良好。2.1.6方法学考察（1）精密度试验：取“2.1.2”项下对照品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果显示，迷迭香酸峰面积的RSD为0.27%（n＝6），表明仪器精密度良好。（2）稳定性试验：取“2.1.3”项下供试品溶液（编号S93），于室温下放置0、2、4、6、12、24 h时，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果显示，迷迭香酸峰面积的RSD为2.6%（n＝6），表明供试品溶液于室温下放置24 h内稳定性良好。（3）重复性试验：取样品（编号S93）0.25 g，共6份，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并按标准曲线法计算迷迭香酸的含量。结果显示，迷迭香酸含量的RSD为0.80%（n＝6），表明方法的重复性良好。（4）加样回收率试验：精密称取已知含量的样品（编号S93，迷迭香酸含量为0.504 6%）0.1 g，共6份，分别精密加入对照品0.5 mg，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率。结果显示，迷迭香酸的平均加样回收率为100.14%（RSD＝0.48%，n＝6），表明方法的准确度良好。2.1.7样品中迷迭香酸含量测定取117批样品，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.1” 项下色谱条件进样测定，记录峰面积并按标准曲线法计算含量。每批样品平行测定2次。结果见表2。10.6039/j.issn.1001-0408.2022.24.10.T002表2迷迭香酸、总黄酮、水分和水溶性浸出物含量的测定结果（n＝2，%）编号迷迭香酸总黄酮水分水溶性浸出物S1～S150.320 5～0.517 53.251 9～5.480 110.351 9～10.888 312.538 1～17.306 5S16～S250.379 7～0.943 05.605 7～6.400 710.897 6～11.707 015.759 2～19.166 2S26～S330.417 0～0.508 03.445 4～3.797 310.435 7～10.988 713.440 0～14.537 8S34～S450.489 7～0.645 45.365 0～5.993 710.807 0～11.496 313.628 0～18.728 1S46～S530.426 2～0.476 04.252 0～4.891 811.104 0～12.189 814.437 1～16.528 3S54～S620.418 8～0.513 43.196 5～3.690 29.880 7～10.589 311.638 8～12.637 5S63～S880.276 7～0.883 23.851 4～5.273 88.736 7～12.446 312.588 6～14.950 0S89～S970.504 6～0.635 94.429 6～5.307 49.360 1～10.065 815.487 7～16.3575S98～S1110.331 1～0.394 02.923 6～3.394 011.232 8～11.929 711.890 0～12.888 7S112～S1170.237 1～0.299 13.047 3～3.478 511.992 3～12.381 413.570 0～14.247 22.2总黄酮的含量测定2.2.1对照品溶液的制备精密称定芦丁对照品4.970 0 mg，用50%乙醇溶解并定容，制得芦丁质量浓度为0.198 8 mg/mL的对照品溶液。2.2.2供试品溶液的制备精密称定样品粉末0.5 g，精密加入50%乙醇15 mL，超声（功率300 W，40 KHz）提取75 min，滤过，即得。2.2.3检测波长的选择精密移取上述对照品溶液1 mL，置于10 mL容量瓶中，加入1% AlCl3 溶液3 mL、醋酸钠-冰醋酸缓冲液1 mL，然后用50%乙醇定容，摇匀，于40 ℃恒温水浴加热10 min；取上述供试品溶液同法操作。以50% 乙醇为空白对照，在250～800 nm波长范围内扫描，结果显示，对照品和供试品溶液均在285 nm波长处有最大吸收，故选择检测波长为285 nm（图略）。2.2.4线性关系考察精密量取上述对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，按“2.2.3”项下方法显色后，于285 nm波长处测定吸光度，以质量浓度为横坐标（X）、吸光度为纵坐标（Y）进行线性回归。结果显示，芦丁的回归方程为Y＝17.051 0X+0.041 4（r＝0.999 8），表明芦丁的检测质量浓度在0.009 9～0.079 5 mg/mL范围内线性关系良好。2.2.5方法学考察（1）精密度试验：取“2.2.2”项下供试品溶液（编号S104），按“2.2.3”项下方法显色后，于285 nm波长处连续测定6次吸光度。结果显示，吸光度的RSD为0.05%（n＝6），表明方法精密度良好。（2）稳定性试验：取“2.2.2”项下供试品溶液（编号S104），按“2.2.3”项下方法显色后，在室温下静置0、30、60、90、120、180 min时，于285 nm波长处测定吸光度。结果显示，吸光度的RSD为1.90%（n＝6），表明样品在室温下放置180 min内稳定性良好。（3）重复性试验：取“2.2.2”项下供试品溶液（编号S104），按“2.2.3”项下方法显色后，于285 nm波长处测定吸光度并按标准曲线法计算样品含量。结果显示，总黄酮含量的RSD为2.38%（n＝6），表明方法重复性良好。（4）加样回收率试验：取已知含量的样品（编号S104，总黄酮含量为4.133 1%），共6份，每份1 g，精密称定，加入芦丁对照品4.1 mg，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2.3”项下方法显色后，于285 nm波长处测定吸光度并计算加样回收率。结果显示，芦丁的平均加样回收率为99.49%（RSD＝1.03%，n＝6），表明方法的准确度良好。2.2.6样品中总黄酮含量测定取117批样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2.3”项下方法显色后，于285 nm波长处测定吸光度并按标准曲线法计算含量。每批样品平行测定2次。结果见表2。2.3水分含量测定按2020年版《中国药典》（四部）通则“0832水分测定法”项下第二法“烘干法”测定水分含量[8]。每批样品平行测定2次。结果见表2。2.4水溶性浸出物含量测定按2020年版《中国药典》（四部）通则“2201浸出物测定法”项下水溶性浸出物测定法中的“热浸法”测定水溶性浸出物含量[8]。每批样品平行测定2次。结果见表2。2.5熵权法计算各指标权重设有m个样品，每个样品有n项评价指标，由此组成单元序列{Xij}（i＝1、2、3……m；j＝1、2、3……n；本研究中n＝4，m＝117）。由于各指标间量纲不统一，需对原始数据进行标准化处理。如果评价指标为正向指标，则采用公式（1）进行标准化处理；如果指标为负向指标，则采用公式（2）进行标准化处理。Yij为标准化处理后的数据，Xij为第i个样品的第j个指标值。（1）（2）根据信息论中信息熵的定义，按公式（3）、（4）计算各个指标的信息熵（E），Ej为样品第j个指标的信息熵，若Pij＝0，则定义lnPij＝0；再按公式（5）计算各指标的权重（Wj）[9－10]。结果见表3。（3）（4）（5）10.6039/j.issn.1001-0408.2022.24.10.T003表3各指标的信息熵及权重结果指标信息熵Wj迷迭香酸0.958 30.297 1总黄酮0.961 10.277 5水分0.977 00.163 7水溶性浸出物0.963 30.261 62.6灰色关联度分析法计算各指标的相对关联度2.6.1无量纲化处理在灰色关联度分析中，首先确定评价单元序列：设有m个样品，每个样品有n项评价指标，由此组成单元序列{Xik}（i＝1、2、3……m；k＝1、2、3……n）。多指标评价中因各指标单位、量级不同，无法进行直接评价，故需对原始数据进行无量纲化处理，计算公式为Yik＝Xik/Xk，Yik为处理后的数据，{Xik}为原始数据，{Xk}为样品第k个指标的平均值[10]。2.6.2相对关联度的计算迷迭香酸、总黄酮、水溶性浸出物含量为正向指标，关联系数ξksi按公式（6）计算（n＝3，m＝117，ρ为“2.5”中熵权法计算所得的权重）；水分含量为负向指标，关联系数ξkti按公式（7）计算（n＝1，m＝117，ρ为“2.5”中熵权法计算所得的权重）；再按公式（8）计算相对关联度（ri）[11]。结果见表4。（6）（7）（8）10.6039/j.issn.1001-0408.2022.24.10.T004表4117批夏枯草的相对关联度及排序结果编号ri排名编号ri排名S10.464 565S600.384 891S20.403 782S610.317 6111S30.469 463S620.342 8107S40.485 550S630.533 518S50.482 655S640.444 674S60.464 764S650.429 479S70.473 859S660.453 769S80.463 066S670.451 270S90.484 852S680.458 368S100.476 957S690.447 872S110.480 556S700.436 478S120.368 198S710.444 375S130.382 493S720.531 519S140.364 1100S730.521 223S150.380 995S740.510 532S160.604 13S750.519 726S170.601 14S760.505 836S180.559 711S770.542 514S190.608 92S780.543 112S200.573 88S790.521 024S210.575 57S800.159 3117S220.584 16S810.257 0115S230.594 25S820.241 5116S240.616 31S830.299 8114S250.500 941S840.316 1112S260.441 476S850.358 1104S270.439 077S860.348 3106S280.401 285S870.335 8109S290.400 886S880.340 2108S300.397 987S890.363 1101S310.402 183S900.381 594S320.429 181S910.402 084S330.429 380S920.366 799S340.495 845S930.378 196S350.495 146S940.375 197S360.522 922S950.397 088S370.470 162S960.301 4113S380.503 139S970.331 7110S390.492 047S980.475 258S400.484 654S990.485 051S410.449 271S1000.485 748S420.471 661S1010.445 173S430.570 69S1020.498 043S440.542 713S1030.530 820S450.539 516S1040.536 317S460.506 635S1050.501 440S470.517 727S1060.495 944S480.472 360S1070.485 749S490.505 637S1080.484 653S500.511 830S1090.539 815S510.527 221S1100.513 629S520.564 710S1110.503 238S530.462 367S1120.509 733S540.362 3103S1130.511 331S550.362 8102S1140.506 734S560.393 090S1150.500 342S570.383 992S1160.515 928S580.393 889S1170.520 625S590.349 81053讨论2020年版《中国药典》仅以迷迭香酸为夏枯草质量控制的唯一活性指标[1]。但由于中药成分复杂，其药效的发挥往往是多个成分协同作用的结果，因此采用多指标评价的方法能更加全面表征药材的质量[12]。有研究发现，夏枯草中所含有的总黄酮具有抗肿瘤、抑菌、降血脂等活性[5]，与夏枯草的药理作用关联度大，此外药材中的水分与水溶性浸出物含量可从药材储藏期、霉变、虫蛀等方面影响药材的质量[13－14]，因此本研究选择迷迭香酸、总黄酮、水分及水溶性浸出物作为夏枯草的指标成分。含量测定结果显示，从迷迭香酸、总黄酮和水溶性浸出物含量来看，以江苏南京（S16～S25）、安徽亳州（S63～S88）等产地药材的含量较高（质量较优）；从水分含量来看，以湖北随州（S89～S97）、河南南阳（S54～S62）等产地药材的含量较低（质量较优）。不同指标的含量测定结果存在差异，因此多指标综合评价夏枯草质量更加科学。本研究通过熵权法对迷迭香酸等4个指标进行客观赋权，再根据各指标的权重计算相对关联度，有效避免了因主观判断误差对权重分配的影响。熵权法分析结果显示，迷迭香酸、总黄酮、水分、水溶性浸出物含量的权重分别为0.297 1、0.277 5、0.163 7、0.261 6，以迷迭香酸含量的权重最大，表明其对夏枯草药材的质量影响最大。总黄酮含量权重排名第2位，提示总黄酮含量也是影响夏枯草药材质量的重要指标。相对关联度结果显示，最大值为0.616 3，最小值为0.159 3，表明不同批次的药材质量存在差异，其中S16～S24批药材质量排名靠前，提示江苏南京产夏枯草质量较优。综上所述，以迷迭香酸、总黄酮、水分及水溶性浸出物含量为评价指标，采用熵权法和灰色关联度分析法可用于夏枯草的质量评价；不同批次夏枯草质量存在差异，以江苏南京产夏枯草质量最优。