过敏性哮喘是一种机体受到外界抗原性或非抗原性刺激产生的气道高反应性呼吸道疾病。目前我国成年人的哮喘发病率约为1.09%，儿童的患病率也在3.02%左右[1]，这已然成为当下我国面临的重大公共卫生问题。过敏体质人群常因受到外界环境如过敏原（花粉、植物和尘螨）、食物、药物、空气污染等因素的刺激，引发气道高反应和气道炎症，出现反复的呼吸困难、喘息、胸闷和咳嗽等症状[2]。西医多通过使用抗炎或支气管扩张药物来达到缓解病情的目的[3]，但临床常用的皮质类固醇等激素类药物容易使人体产生耐药性，且长期使用会导致机体代谢紊乱。因此，越来越多的患者选择中医辨证论治或中西医结合进行治疗。中医将过敏性哮喘定义为“哮病”，分为热哮、寒哮等，其中寒哮的特征与西医的过敏性哮喘比较接近。因此，从治疗寒哮的温肺散寒、化痰定喘类中药中寻找防治过敏性哮喘的有效药物已成为研究热点[4]。五味子为木兰科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill的干燥成熟果实，具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心的功效[5]。在医圣张仲景的射干麻黄汤、小青龙汤以及临床经验方加味过敏煎、哮喘方等治疗过敏性哮喘的经典名方中，五味子均发挥了敛肺、止咳、平喘之功[6―7]。临床亦有用五味子单方治疗经期哮喘的案例[8]。研究表明，五味子中含有木脂素、黄酮、有机酸、挥发油等化学成分[9]；五味子水煎液、五味子木脂素和挥发油均可通过抑制辅助型T细胞2（T helper 2 cell，Th2）相关炎症因子、缓解肺部炎症浸润来改善哮喘症状[10―11]。上述研究提示，五味子治疗哮喘的效果可观，且应用前景理想，但其潜在的药效物质基础还不十分明确。五味子在临床常与其他中药配伍后以水煎液的形式应用于治疗过敏性哮喘。因此，本研究采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱（UPLC-Q-TOF-MS/MS）技术分析不同批次五味子水煎液中的共有成分，并采用灰色关联度和Pearson相关性分析法探讨其共有峰与治疗过敏性哮喘之间的关系，筛选活性成分，旨在初步阐明五味子治疗过敏性哮喘的潜在药效物质基础。1材料1.1主要仪器本研究所用的主要仪器有ACQUITY型UPLC仪（美国Waters公司）、液相色谱-G6500系列四极杆-飞行时间质谱联用仪（美国Agilent公司）、BSA型万分之一电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）、iMark型酶标仪（上海伯乐生命医药产品有限公司）。1.2主要药品与试剂10批五味子药材分别购自各地药材市场或自采，经哈尔滨商业大学药学院曲中原教授鉴定均为木兰科植物五味子S. chinensis（Turcz.）Baill的干燥成熟果实，药材具体来源信息见表1。五味子醇甲对照品（批号MUST-18031905）、戈米辛J对照品（批号MUST-18041102）和戈米辛M2对照品（批号MUST-18010412）均购自成都曼斯特生物科技有限公司，纯度均大于98%；五味子醇乙对照品（批号AM407S）、五味子甲素对照品（批号AM268S）、五味子乙素对照品（批号AB266S）和五味子丙素对照品（批号AM509W）均购自天津一方科技有限公司，纯度均大于98%；卵白蛋白（ovalbumin，OVA；批号9006-59-1）购自北京博奥生物集团有限公司；百令胶囊（批号18010016，规格每粒0.5 g）购自杭州中美华东制药有限公司；γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ）、白细胞介素4（interleukin-4，IL-4）和免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）酶联免疫吸附检测试剂盒（批号分别为elisa3578、elisa1033、elisa2444）均购自上海广锐生物科技有限公司；色谱级甲醇、乙腈购自德国Merck KGaA公司，色谱级甲酸购自美国Fisher公司，其他试剂均为分析纯，水为屈臣氏蒸馏水。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.03.12.T001表1五味子药材样品的来源信息编号产地获得途径购买批号采集时间S1辽宁省铁岭市购自哈尔滨三棵树中药材专业市场18050137S2吉林省通化市购自哈尔滨三棵树中药材专业市场18040093S3吉林省白山市购自哈尔滨三棵树中药材专业市场18050276S4辽宁省抚顺市购自哈尔滨三棵树中药材专业市场18050251S5吉林省通化市购自哈尔滨三棵树中药材专业市场18060300S6黑龙江省哈尔滨市自行采集2018年6月S7黑龙江省五常市购自哈尔滨三棵树中药材专业市场18100052S8黑龙江省尚志市自行采集2018年6月S9辽宁省本溪市购自哈尔滨三棵树中药材专业市场19030122S10黑龙江省尚志市自行采集2019年5月1.3动物本研究所用动物为健康SPF级雄性SD大鼠，共104只，体质量为170～190 g，购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，实验动物生产合格证号为SCXK（吉）- 2018-0007。饲养室空气状况良好，温度适宜，相对湿度为40％～70％，12 h/12 h光照昼夜循环。实验前连续适应性饲养7 d，实验过程中食物和水充足。动物实验经哈尔滨商业大学药学院动物伦理委员会批准后实施（批准号为201803009）。2方法2.1不同批次五味子水煎液的UPLC-Q-TOF-MS/MS分析2.1.1供试品溶液的制备分别取10批五味子供试品粉末各1 g，按料液比1∶10（g/mL，下同）加水回流提取1 h，过滤后滤渣再按1∶8的料液比加水回流提取1 h，过滤后合并2次滤液，置于水浴锅上浓缩成浸膏（得率为13.5%～14.3%）。取全部浸膏，加适量乙腈定容于10 mL容量瓶中，制成质量浓度为0.1 g/mL（按生药量计）的五味子供试品溶液，经0.22 μm微孔滤膜过滤，收集滤液，并记为SG1～SG10，备用。2.1.2对照品溶液的制备精密称取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、戈米辛J、戈米辛M2对照品各3.0 mg，分别置于10 mL容量瓶中，加乙腈超声（功率200 W，频率40 kHz）5 min溶解，待冷却后，用乙腈定容，得到各对照品质量浓度均为0.3 mg/mL的单一对照品溶液。2.1.3色谱条件采用ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）色谱柱，以0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B）为流动相进行梯度洗脱（0～3 min，23%B；3～7 min，23%B→40%B；7～8 min，40%B→42%B；8～11 min，42%B→55%B；11～13 min，55%B→65%B；13～14 min，65%B→75%B；14～19 min，75%B→100%B；19～23 min，100%B→23%B）；流速为0.2 mL/min；柱温为35 ℃；进样量为5 μL；检测波长为216 nm。2.1.4质谱条件离子化模式为电喷雾正离子模式；离子源电压为5 500 V；离子源温度为550 ℃；裂解电压为80 V，碰撞能量为35 eV；气帘气压力为35.0 psi；离子源气体1压力为55.0 psi，离子源气体2压力为5.0 psi；一级质谱母离子扫描范围为质荷比（m/z）80～1 500；信息依赖式采集（information-dependent acqusition，IDA）设置响应值超过100 cps的8个最高峰进行二级质谱扫描，子离子扫描范围为m/z 50～1 500。2.1.5化学成分解析在CNKI、PubChem、ChemSpider等数据库中查询五味子中化学成分的名称、分子式、相对分子质量、结构式等信息，建立五味子成分数据库。将UPLC-Q-TOF-MS/MS分析中化学成分的一级离子峰、二级碎片离子及保留时间等信息与所建立的数据库进行比对，同时结合对照品数据信息和文献资料对化学成分进行鉴定。2.2不同批次五味子水煎液治疗过敏性哮喘的药效比较研究2.2.1试药的制备取10批五味子样品，分别按“2.1.1”项下方法制备浸膏。取适量浸膏加水溶解，制成质量浓度为0.9 g/mL（按生药量计）的灌胃溶液，并记为C1～C10。2.2.2大鼠过敏性哮喘模型的建立及给药取SD大鼠按体质量分层随机分为空白组、模型组、阳性对照药（百令胶囊）组和10批样品给药组，分别编号为A1～A13组，每组8只。除A1组外，其余各组大鼠均参照文献[12－13]方法造模：分别于实验第1、8、14天腹腔注射新鲜配制的生理盐水混悬液[含OVA 60 mg（5%）和氢氧化铝凝胶100 mg（10%）]，每次每只大鼠注射1 mL。并从实验第15天起连续16 d将大鼠放入自制雾化箱中，吸入含1%OVA的生理盐水进行雾化激发（20 min）。A1组以生理盐水代替混悬液进行腹腔注射和雾化激发。于实验第15天起，在雾化激发前，A1～A2组大鼠灌胃给予生理盐水，A3组大鼠灌胃给予百令胶囊0.92 g/kg[本研究按成人（体质量60 kg）百令胶囊的临床用药最大剂量9 g，换算成大鼠等效剂量约为0.92 g/kg]；A4～A13组大鼠分别灌胃给予10批五味子水煎液1.23 g/kg（以生药量计），剂量依据前期预实验结果设置。2.2.3大鼠一般行为学观察末次雾化1 h后，观察各组大鼠的皮毛光泽度、精神状态以及是否有呼吸急促、搔鼻、打喷嚏等现象。2.2.4血清中IFN-γ、IL-4和IgE含量测定末次雾化1 h后，大鼠摘眼球取血（每只大约取5～8 mL），分别放于EP管中，在室温条件下静置30 min，然后以3 000 r/min离心15 min。用移液枪小心吸取上层血清，按试剂盒说明书分别测定血清中IFN-γ、IL-4和IgE的含量。2.3不同批次五味子共有成分与血清药效指标的相关性分析2.3.1灰色关联度分析将IFN-γ、IL-4和IgE含量作为母本子序列，共有峰的峰面积作为子序列，采用均值变化法进行无量纲化处理。按照公式ξi(k)= minΔi(k)+ρmaxΔi(k)Δi(k)+ρmaxΔi(k)计算母本子序列与子序列的灰色关联系数。式中，Δi（k）为比较序列与参考序列差值的绝对值；ρ作为分辨系数，一般在0～1之间取值，通常选择0.5[14]。然后按下列公式计算关联度（r）： r=1n∑k=1nξi(k)。式中，n表示各序列的数据数量。当r≥0.7时，表示母本子序列与子序列间关联程度较高；当r为0.6～＜0.7时，表示母本子序列与子序列间关联程度低[14]。2.3.2Pearson相关性分析将各共有峰的峰面积定义为X，IFN-γ、IL-4和IgE的含量定义为Y，采用SPSS 25.0软件对X和Y进行Pearson相关性分析。2.4统计学方法采用IBM SPSS Statistics 21.0软件进行统计分析。实验结果以x±s表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。3结果3.1不同批次五味子水煎液的UPLC-Q-TOF-MS/MS化学成分鉴定结果在正离子模式下采集五味子不同批次样品的质谱信息，分别提取其基峰离子色谱图（base peak chromatogram，BPC）并进行叠加，BPC叠加图见图1。通过与相关文献和对照品比对，最终在10批样品间共确定21个共有峰（依次记为F1～F21），主要为木脂素类、有机酸类和倍半萜类化合物（表2）。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.03.12.F001图110批五味子样品的BPC叠加图和共有峰10.6039/j.issn.1001-0408.2023.03.12.T002表210批五味子水煎液的共有成分编号tR/min理论值检测值误差/ppm离子碎片m/z分子式化合物文献11.4221.065 6221.065 6－0.55221.065 6，157.049 6，139.002 5，129.018 0，115.038 5C8H12O7柠檬酸二甲酯[15]27.1455.352 0455.351 7－0.50455.351 7，437.338 2，419.331 0，401.320 9，381.883 1，357.285 1C30H46O3甘五酸[16]37.2433.222 3433.221 62.04433.221 6，418.218 2，387.182 6C24H32O7五味子醇甲a[16]47.4389.194 0389.195 31.46389.195 3，357.168 9，325.141 8C22H28O6戈米辛 Ja[16]57.6417.190 9416.183 7－0.59416.183 7，399.180 5，357.132 8，314.115 1，285.109 0C23H28O7五味子醇乙a[16]67.9391.211 3391.211 20.81391.211 2，327.159 7，257.277 3C22H30O6前戈米辛[16]78.1501.248 3501.247 61.39501.247 6，483.237 3，452.217 5，437.195 7，427.174 7，414.165 0C28H36O8当归酰戈米辛H[17]88.5483.237 7483.237 40.27483.237 4，451.211 2，437.195 9，395.148 0，381.131 7C28H34O7葛杜宁[17]98.8386.180 2387.179 71.33387.179 7，372.153 2，355.150 8，325.142 6，285.073 4C22H26O6戈米辛M2a[16]108.9431.206 4431.206 5－0.16431.206 5，400.184 0，372.156 0C24H30O7schinsanlignone A[17]119.1536.571 9536.203 91.93536.203 9，371.147 9，341.137 2C30H32O9五味子酯甲[16]129.7522.586 2523.231 12.39523.231 1，493.186 5，386.169 3C28H36O8苯甲酰戈米辛H[16]1310.1415.175 1415.175 4－0.17415.175 4，385.164 4，371.148 8C23H26O7新异五加内酯素[17]1410.7402.481 5403.211 10.78403.211 1，388.187 9，340.166 7，325.143 5，301.107 1C23H30O6五味子酚[18]1511.1514.564 1515.226 81.48515.226 8，469.221 0，385.164 7，339.122 5，316.094 6，301.206 2C28H34O9五味子酯乙[16]1613.5331.190 4331.284 2－0.04331.284 2，313.273 0，284.315 6C20H26O4内消旋二氢愈疮木酸[16]1713.9219.174 3219.172 11.57219.172 1，201.164 4，175.146 3C15H22O恰米醛[16]1814.2417.223 7417.226 22.08417.226 2，371.182 8，332.125 3C24H32O6五味子甲素a[16]1917.1401.195 7401.194 81.66401.194 8，386.171 9，300.099 2，285.075 6，269.079 8C23H28O6五味子乙素a[16]2018.4385.164 6385.165 01.27384.156 8，355.153 0，285.075 6C22H24O6五味子丙素a[16]2118.6485.253 4485.251 20.99485.251 2，403.207 5，371.179 0C28H36O7当归酰戈米辛K3[19]a：通过与对照品比对确证的化合物3.2不同批次五味子水煎液治疗过敏性哮喘的药效考察结果3.2.1一般行为学观察结果在实验第1～14天腹腔注射OVA致敏期间，各组大鼠均没有出现明显症状；于实验第15天雾化激发开始后，与A1组比较，A2组大鼠逐渐出现呼吸急促、咳嗽、打喷嚏等现象，同时伴有皮毛无光泽、身体消瘦、精神不振、蜷卧等症状。给药前，A3～A13组大鼠的一般情况与A2组大鼠无明显差别；给药16 d后，A3～A13组大鼠皮毛颜色光亮，呼吸急促、咳嗽、打喷嚏和蜷缩等症状减轻，整体状态得到改善。3.2.2血清中IFN-γ、IL-4和IgE含量测定结果与A1组比较，A2组大鼠血清中IFN-γ含量显著降低（P＜0.01），IL-4、IgE含量均显著升高（P＜0.01）。与A2组比较，A3～A13组大鼠血清中IFN-γ含量均显著升高（P＜0.01），IL-4、IgE含量均显著降低（P＜0.01）。结果见图2。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.03.12.F002图2各组大鼠血清中IFN-γ、IL-4和IgE含量测定结果（x±s，n＝8）a：与A1组比较，P＜0.01；b：与A2组比较，P＜0.013.3不同批次五味子共有成分与血清药效指标的相关性分析结果灰色关联度分析结果显示，有11个峰与IFN-γ、IL-4和IgE关联度的平均值（r¯）＞0.8，这11个共有峰的平均关联度大小为峰18＞峰9＞峰3＞峰7＞峰5＞峰4＞峰12＞峰6＞峰19＞峰17＞峰20。Pearson相关性分析结果显示，峰3～7、9、19、20与IFN-γ的含量呈显著正相关（P＜0.05），峰3～7、9、18～20与IL-4的含量呈显著负相关（P＜0.05），峰3、4、6、7、9、18～20与IgE的含量呈显著负相关（P＜0.05），该结果提示潜在的活性成分为峰3、4、6、7、9、19、20代表的成分。将上述2种分析结果取交集，最终筛选出峰3、4、6、7、9、19、20代表的成分可能为五味子治疗过敏性哮喘的潜在药效物质（图3）。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.03.12.F003图3五味子各共有峰与药效指标灰色关联度和Pearson相关性分析结果4讨论过敏性哮喘是一种常见的慢性气道炎症性疾病。在变应原诱导的哮喘中，IgE介导、T细胞依赖的炎症反应机制起了主要作用。近年来，有学者提出哮喘发作与Th1/Th2类细胞因子比例失衡相关。哮喘发作时患者体内Th1细胞亚群百分比降低，Th2细胞亚群百分比升高，导致Th1细胞分泌的细胞因子（如IFN-γ）的表达量降低，Th2细胞分泌的细胞因子（如IL-4）的表达量升高。Th1/Th2比例失衡，致使Th2细胞过度分化，这将会诱导B细胞合成IgE，同时抑制T细胞向Th1分化，进而加剧Th1/Th2比例失衡[20―21]。因此，本研究选择IFN-γ、IL-4和IgE含量作为指标来进行治疗过敏性哮喘的药效学评价。在本研究中，A2组大鼠出现呼吸急促、咳嗽、精神不振等哮喘相关症状，同时血清中IFN-γ含量显著低于A1组，IL-4和IgE含量均显著高于A1组。然而相比于A2组，A3～A13组大鼠喘咳等症状明显减轻，血清中IFN-γ含量均显著升高，IL-4和IgE含量均显著降低（P＜0.01）。结果表明，10批不同产地五味子均能够改善过敏性哮喘模型大鼠Th1/Th2比例的失衡，进而抑制IgE生成，减轻呼吸道炎症反应。本研究结合灰色关联度和Pearson相关性分析结果，推测出五味子醇甲、五味子乙素、五味子丙素、戈米辛M2、戈米辛J、前戈米辛和当归酰戈米辛H这7种成分可能为五味子治疗过敏性哮喘的有效成分。通过查阅文献，笔者发现五味子醇甲有舒缓气道平滑肌的作用[22]，且可能通过阻断钙离子通道发挥作用[22]。五味子乙素可通过减少嗜酸性粒细胞，抑制氧化应激，改善肺部炎症因子表达，改善哮喘症状[23]。吕希等[24]通过网络药理学研究筛选出五味子丙素为五味子中治疗哮喘的靶标成分，这与本研究结果相互印证。本研究结果为进一步探究这7种成分治疗过敏性哮喘的药效和机制提供了数据支持和理论支撑。综上，本研究运用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术分析得到10批五味子水煎液之间的21个共有成分，并结合药效学实验，采用相关性分析方法筛选出五味子醇甲、五味子乙素、五味子丙素、戈米辛M2、戈米辛J、前戈米辛和当归酰戈米辛H可能为五味子治疗过敏性哮喘的药效物质。但此结果仅根据药效指标与共有峰峰面积数据进行简单统计学分析后得出的，具有一定的片面性和不确定性，有待于进一步建立动物哮喘模型进行验证。