骨缺损又被称为节段性骨丢失，其病因复杂多样，包括高能创伤、骨肿瘤、感染等，会导致患者肢体功能缺失，严重影响患者的生活质量[1]。目前临床上对大段骨缺损尚无确切定义，一般将缺损范围达到骨周径50%以上或长度2 cm以上的骨丢失称为大段骨缺损[2]。骨缺损难以自行愈合，其修复有赖于血管生成与骨生成的协调[3]，然而目前临床上的治疗方案成本高且应用局限[4]。因此，开发具有体内血管和骨生成能力的药物/材料在骨缺损治疗方面有极大潜力。补益肝肾中药可有效促进骨折愈合。据研究报道，补肾中药一方面可通过生长因子诱导，促进骨折端血管形成，改善血液循环[5―7]；另一方面可促进骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSC）增殖与成骨分化[8―10]。本课题组早期研究发现，骨碎补总黄酮（total flavonoids of Rhizoma Drynariae，TFRD）具有促进牵张成骨间隙中的骨形成和重塑功能[11]，可能通过磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信号通路促进骨缺损血管生成和成骨[12]。TFRD有效成分较复杂，在其所有单体成分中，山柰酚、柚皮苷和木犀草素的活性最好，均具有促进成骨分化的作用[13―15]。从目前的研究进展来看，柚皮苷及山柰酚促进成骨的相关研究较多，而木犀草素相对较少，因此，本研究以既往实验结果为基础[16]，通过网络药理学和分子对接寻找木犀草素适配靶点蛋白及信号通路，以大鼠BMSC及大鼠脐周静脉内皮细胞（rat umbilical vein endothelial cells，RUVEC）为研究对象，在细胞层面验证木犀草素与TFRD相似的促进成骨、成血管的功能机制，以期为骨缺损治疗挖掘潜在的药物。1材料1.1主要仪器TGL-16c型冷冻离心机购自湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；SCO6WE型恒温培养箱购自美国SHEL-LAB公司；DMi8-M型倒置显微镜购自德国Leica公司；DR-200Bs型酶标检测仪购自无锡华卫德朗仪器有限公司；PowerPac Basic型电泳仪购自美国Bio-Rad公司；Micro Publisher型成像系统购自加拿大QImaging公司；WD-9405F型脱色摇床购自北京六一仪器有限公司；FB201型扫描仪购自日本Canon公司。1.2主要药品与试剂木犀草素溶液（批号DA21442，纯度≥98％）购自南京道斯夫生物科技有限公司；磷酸盐缓冲液（PBS）、DMEM低糖培养基、胎牛血清均购自美国Gibco公司；BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒（批号C3206）、成骨细胞钙化结节染色试剂盒（批号C0148S）、RIPA细胞总蛋白裂解液（批号P0013B）、BCA蛋白定量试剂盒（批号P0010S）、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）试剂盒（批号P0012A）、Western blot封闭液、胰蛋白酶、茜素红S染色液均购自上海碧云天生物技术有限公司；基质胶（批号356234）购自美国Corning公司；鼠源Akt1抗体（批号AF6261）、鼠源PI3K抗体（批号AF6241）、辣根过氧化物酶标记的鼠源免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）二抗（批号S0001）均购自美国Affinity公司；聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜，批号IPFL00010）购自德国默克公司；ECL超敏化学发光液（批号P10100）购自苏州新赛美生物科技有限公司；其余试剂为实验室常用规格，水为超纯水。1.3细胞大鼠BMSC、RUVEC（批号分别为CP-R131、CP-R232）均购自武汉普诺赛生命科技有限公司。2方法2.1网络药理学分析2.1.1木犀草素的靶点预测通过PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取木犀草素的分子结构，通过SwissTargetPrediction在线平台（http：//www.swisstargetprediction.ch/）预测木犀草素的潜在靶点；利用UniProtKB数据库（https：//www.uniprot.org/）使靶点名称标准化，并删除重复数据。2.1.2骨缺损相关靶点的收集以“traumatic bone defect”为关键词在GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）、PharmGKB数据库（https：//www.pharmgkb.org/）、NCBI数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中搜索与骨缺损发病相关的靶点。合并去重后，将骨缺损相关靶点与木犀草素预测靶点导入Venny 2.1软件得到交集靶点并绘制Venny图，得到的交集靶点为木犀草素治疗骨缺损的潜在作用靶点。2.1.3核心靶点蛋白质-蛋白质相互作用分析及Hub基因的筛选通过String数据库（https：//cn.string-db.org/）对核心靶点蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）进行分析，得到PPI网络图；利用Cytoscape 3.8软件对PPI网络进行拓扑学分析，以度值（degree）、介数中心性（betweenness centrality，BC）、接近中心性（closeness centrality，CC）等参数筛选2次，获得PPI网络中的核心蛋白。2.1.4京都基因与基因组百科全书信号通路富集分析和基因本体功能富集分析利用Kobas数据库（http：//kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3/）对木犀草素治疗骨缺损的潜在作用靶点进行京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信号通路富集分析和基因本体（gene ontology，GO）功能富集分析，筛选出P＜0.05的信号通路和生物过程（biological procsee）、细胞组分（cellular component）、分子功能（molecular function）条目。对重要性排名前20位的KEGG信号通路和排名前10位的GO功能条目绘制气泡图和柱状图，并构建“成分-靶点-信号通路”可视化网络。2.2分子对接通过分子对接技术分析核心靶点与木犀草素的作用关系。从PubChem数据库得到木犀草素的分子结构，将其导入Chem 3D软件进行能量最小化，得到小分子的pdb文件；在PDB数据库（https：//www.rcsb.org/）中搜索核心靶点蛋白的结构，利用PyMOL软件删除水分子和小分子配体；最后利用AutoDock Tool 1.5.7软件将处理得到的木犀草素小分子和核心靶点进行分子对接，以验证结果的可靠性。以木犀草素与核心靶点的对接结合能来评价结合亲和力，若结合能＜－5 kJ/mol，说明具有结合亲和力，且结合能的数值越低，说明结合亲和力越强，结合越稳定。2.3体外实验验证2.3.1细胞培养与传代将冻存的RUVEC和BMSC在37 ℃水浴中复温后，在超净台分别转入含5 mL完全培养基的15 mL离心管中，在24 ℃以1 200 r/min离心5 min去上清液。重新添加5 mL完全培养基，混匀后移入培养皿中，在37 ℃、5% CO2的培养箱中孵育，第2天更换培养基。待细胞生长至融合度为80%～90%时进行传代。吸除培养基，加入2 mL PBS清洗3次。去除PBS，加入2 mL 0.25%胰蛋白酶进行消化，待细胞圆缩后，加入4 mL完全培养基吹打混匀终止消化，用15 mL离心管暂存细胞悬液，然后在24 ℃以1 200 r/min离心5 min，去除上清液，加6 mL完全培养基至细胞沉淀，吹打混匀后，分别转移至2个培养皿中，补全完全培养基至5 mL。移入37 ℃、5% CO2的培养箱培养，24 h后换液，显微镜观察，待细胞贴壁融合后换液；用不含血清的DMEM培养液培养24 h，用于后续实验。2.3.2细胞碱性磷酸酶活性检测采用碱性磷酸酶染色。选取3代BMSC消化接种于24孔板中，1 d后分别给予含不同浓度木犀草素溶液（0、1、10 μmol/L）的成骨诱导液进行干预，给药剂量参考文献[15]和本课题组前期预实验结果设置。每3 d更换1次培养基，7 d后使用BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒染色，首先吸出残余培养基，使用PBS清洗2次，再使用含4%多聚甲醛的细胞固定液固定细胞，室温条件下固定30 min后去除残留液体，用PBS冲洗3次，每次5 min。然后按照说明书配制染色工作液并加入24孔板中，37 ℃恒温孵育30 min，每5 min查看1次，显色达到预期深浅即终止。去除残留液体，用PBS清洗2次，终止反应。最后置于扫描仪下观察显色深度并拍照，实验共重复3次。以碱性磷酸酶染色后孔板中蓝色深度及分布范围为评价标准，颜色越深，分布范围越广，说明细胞碱性磷酸酶活性越高。2.3.3细胞钙化情况检测采用茜素红S染色。选取3代BMSC消化接种于24孔板中，1 d后分别给予含不同浓度木犀草素溶液（0、1、10 μmol/L）的成骨诱导液进行干预，给药剂量参考文献[15]和本课题组前期预实验结果设置。每3 d更换1次培养基，14 d后使用成骨细胞钙化结节染色试剂盒进行染色。首先吸出残余培养基，以PBS清洗2次，再使用含4%多聚甲醛的细胞固定液固定细胞，室温条件下固定30 min后去除残留液体，用PBS冲洗3次，每次5 min。然后加入茜素红S染色液，37 ℃恒温孵育30 min，每5 min查看1次，显色达到预期深浅即终止。去除染色液，用PBS清洗2次，终止反应。最后置于扫描仪下观察显色深度并拍照，实验共重复3次。以茜素红S染色后孔板中红色深度及分布范围为评价标准，颜色越深，分布范围越广，说明钙盐沉积越多，钙化结节数量越多。2.3.4细胞血管分化能力检测采用体外血管形成实验检测。实验前1 d将基质胶、1盒100 μL枪头置于冰盒中，放入4 ℃冰箱过夜，使基质胶能够在低温条件下融化。实验当天使用预冷的枪头将基质胶在冰上接种到血管生成载玻片上，每孔10 μL均匀覆盖板底，避免产生气泡，随后将血管生成载玻片的盖子盖上，置于10 cm的培养皿中，放入浸水的纸巾，制成1个湿盒，将其放入37 ℃、5% CO2的培养箱中，孵育30 min以固化基质胶。将50 μL经不同浓度木犀草素溶液（0、1、10 μmol/L）预处理的RUVEC（5 000个细胞）加入血管生成载玻片中并在37 ℃、5% CO2培养箱培养6 h，给药剂量参考文献[15]和本课题组前期预实验结果设置。随后在倒置显微镜下的5个随机视野中观察RUVEC的形态变化和血管形成情况，实验共重复3次。使用Image J软件中的“Analyze HUVEC Phase Contrast”函数计算平均血管长度。2.3.5细胞内PI3K、Akt1蛋白检测采用Western blot法检测，以验证网络药理学方法识别到的木犀草素成骨、成血管潜在调节靶点及作用途径的可靠性。将BMSC接种到6孔板上，给予含不同浓度木犀草素溶液（0、1、10 μmol/L）的成骨诱导液干预7 d，给药剂量参考文献[15]和本课题组前期预实验结果设置。用PBS冲洗贴壁细胞3次，弃废液，然后加入适当体积的细胞总蛋白裂解液裂解；同时，用细胞刮刀刮下细胞和试剂，转到1.5 mL EP管中。冰上静置30 min，每隔5 min震荡混匀1次。在4 ℃以12 000 r/min离心30 min，收集上清液，即为总蛋白溶液。使用BCA蛋白定量试剂盒测定其蛋白浓度，随后将蛋白在6％浓度的电泳凝胶上电泳分离，并通过电印迹转移至PVDF膜上。将PVDF膜在室温下于封闭液中封闭45 min，然后在4 ℃与Akt1抗体、PI3K抗体（稀释度均为1∶1 000）一起孵育过夜。洗涤3次后，将目标蛋白条带与二抗（稀释度为1∶5 000）在室温下孵育1 h。加入显影液后进行目的蛋白显影，实验共重复3次。使用Image J软件对条带进行灰度值分析，以PI3K、Akt1与内参蛋白（β-actin）条带灰度值的比值表示目的蛋白表达水平。2.4统计学处理采用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料满足正态分布以x±s表示，多组间比较采用方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。3结果3.1网络药理学分析结果3.1.1木犀草素、骨缺损相关靶点及潜在作用靶点通过PubChem数据库共筛选得到木犀草素的潜在靶点103个。通过Genecards、PharmGKB、NCBI数据库搜索并汇总、去重后，共得到骨缺损相关靶点14 161个。利用Venny 2.1软件，得到骨缺损与木犀草素交集的靶点97个，即为木犀草素治疗骨缺损的潜在作用靶点。3.1.2PPI分析及Hub基因筛选结果将上述97个交集靶点导入String数据库和Cytoscape 3.8软件，得到PPI网络图；隐藏游离节点，对PPI网络进行拓扑学分析，结果显示，该网络中包含92个节点和996条边，网络中节点越大、颜色越深，节点的degree值越大，代表其在PPI网络中的作用越重要。利用网络拓扑学参数进行Hub基因筛选，第1次以degree值大于2倍中位数，BC值、CC值大于中位数为条件筛选，第2次以degree值、BC值、CC值大于中位数为条件筛选（图1），最终得到12个Hub基因，排名前6位依次为Akt1、SRC、雌激素受体1（estrogen receptor 1，ESR1）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、环加氧酶2（cyclooxygenase 2，PTGS2）、基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.07.08.F001图1Hub基因筛选过程3.1.3KEGG信号通路富集分析结果通过KEGG富集得到197条信号通路，选取重要性排名前20位的信号通路绘制气泡图（图2）。结果显示，潜在靶点主要富集在肿瘤中的通路（pathways in cancer）、氮代谢（nitrogen metabolism）和PI3K/Akt信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）等相关通路中。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.07.08.F002图2排名前20位的KEGG信号通路气泡图注：图中气泡大小、颜色与富集基因数目和通路显著性有关，气泡越大表示富集基因数目越多，颜色越深表示通路越显著3.1.4GO功能富集分析结果GO功能富集分析共得到1 670条GO条目，选取重要性排名前10位的条目进行可视化分析（图3）。结果显示，其生物过程涉及蛋白质磷酸化（protein phosphorylation）、凋亡过程的负反馈调节（negative regulation of apoptotic process）、对外源刺激的反应（response to xenobiotic stimulus）等；细胞组成涉及胞质溶胶（cytosol）、细胞质（cytoplasm）、细胞核（nucleus）等；分子功能主要集中于蛋白激酶活性（protein kinase activity）、碳酸盐脱水酶活性（carbonate dehydratase activity）、三磷酸腺苷结合（ATP binding）等。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.07.08.F003图3排名前10位的GO功能富集分析柱状图3.1.5分子对接验证结果本研究以木犀草素为研究载体，以重要性排名前2位的靶点（Akt1、SRC）进行分子对接。结果表明，木犀草素与Akt1、SRC的结合能分别为 －34.2、－20.8 kJ/mol，均小于－5 kJ/mol，表明均具有较强的结合力，相互作用关系见图4。其中，木犀草素与Akt1的氨基酸残基LYS179、ALA230、ASN279形成氢键相互作用，与SRC的氨基酸残基GLU339、GLU157、LYS321、TYR326形成氢键相互作用。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.07.08.F004图4木犀草素与核心靶点基因编码蛋白的分子对接图3.2体外实验验证结果3.2.1木犀草素对BMSC成骨分化的影响碱性磷酸酶染色结果显示，木犀草素0 μmol/L组蓝色几乎不可见，木犀草素1 μmol/L组则相对明显，木犀草素10 μmol/L组显色最深，这表明木犀草素能显著增高BMSC内碱性磷酸酶的表达水平和活性，见图5A。茜素红S染色结果显示，木犀草素0 μmol/L组红色较浅、范围较小，木犀草素1 μmol/L组显色相对明显，木犀草素10 μmol/L组显色最深、范围最广，这表明木犀草素能显著增加BMSC内的钙盐沉积和钙化结节数量，促进BMSC的钙化，见图5B。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.07.08.F005图5木犀草素对BMSC成骨分化的影响3.2.2木犀草素对RUVEC体外血管形成的影响体外血管形成实验结果表明，与木犀草素0 μmol/L组比较，木犀草素1、10 μmol/L组细胞血管形成能力显著增强，血管长度显著增加（P＜0.05或P＜0.01），联结长度更长，网状结构更多，且10 μmol/L组效果更显著，见图6。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.07.08.F006图6木犀草素对RUVEC体外血管形成的影响a：与木犀草素0 μmol/L组比较，P＜0.05；b：与木犀草素0 μmol/L组比较，P＜0.013.2.3木犀草素对BMSC内PI3K、Akt1蛋白表达的影响与木犀草素0 μmol/L组比较，木犀草素1、10 μmol/L组细胞PI3K、Akt1蛋白表达水平显著提高（P＜0.05或P＜0.01），且木犀草素浓度越高，PI3K、Akt1蛋白表达水平提高越显著，见图7。由此进一步表明，木犀草素能够激活PI3K/Akt信号通路，促进PI3K、Akt1蛋白的表达，从而增强成骨分化。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.07.08.F007图7木犀草素对BMSC内PI3K、Akt1蛋白表达的影响a：与木犀草素0 μmol/L组比较，P＜0.05；b：与木犀草素0 μmol/L组比较，P＜0.014讨论骨修复是一个依赖血管维持的过程，血管不仅为骨缺损部位提供营养物质、矿物质、生长因子，同时也是修复细胞进入骨缺损区的通道，是骨结构重新构建的基础[17]。更为重要的是，调控骨再生相关的细胞和信号分子同样受其影响，因此骨缺损修复极其依赖成血管-成骨耦联这一过程[18]。本研究在本课题组前期研究的基础上[6―7]，通过网络药理学和分子对接筛选出了木犀草素的主要作用靶点，随后用细胞实验验证了筛选的结果及木犀草素对骨缺损血管的生成及骨修复作用。本次网络药理学研究结果显示，木犀草素和骨缺损的共同作用靶点主要分布在PI3K/Akt信号通路中，而PI3K/Akt信号通路已被证明可促进成骨细胞形成[19]，如TFRD可通过PI3K/Akt途径促进大鼠牙髓干细胞的成骨分化[20]。通过Hub基因筛选，Akt1、SRC、ESR1被发现为重要性排前3位的靶点。以往研究显示，Akt1和EGFR可以促进骨髓细胞的增殖和分化，并抑制细胞凋亡[21―22]。而SRC蛋白的磷酸化则被证实可以通过ESR1依赖的非经典信号通路激活，从而促进成骨[23]。分子对接结果显示，Akt1、SRC与木犀草素的结合能均不高于－5.0 kJ/mol，提示木犀草素可能通过作用于Akt1、SRC发挥治疗作用。木犀草素与靶点的结合模式包括与赖氨酸（LYS）、丙氨酸（ALA）、天冬酰胺（ASN）、谷氨酸（GLU）、酪氨酸（TYR）的残基结合等，提示木犀草素可通过与核心靶点多位点结合发挥作用，这与中医的“多靶点、多通路”治疗疾病理论相呼应。本研究通过实验验证发现，木犀草素对RUVEC的体外血管形成有促进作用。研究报道，内皮细胞增殖启动后会增加对细胞凋亡的抵抗力，使得蛋白水解平衡变化，促进细胞骨架重组、迁移及分化，最终促进新血管腔形成[24―25]。本研究结果显示，不同浓度的木犀草素对RUVEC的体外血管形成均具有明显的促进作用。与木犀草素0 μmol/L组比较，木犀草素1 μmol/L组与10 μmol/L组的RUVEC血管形成能力增强、联结长度更长、网状结构更多。这可认为木犀草素启动了血管生成信号，为血管长入提供了分子基础。本研究结果还显示，木犀草素能够显著增加血管长度。以上结果提示，在体外条件下木犀草素可有效促进血管生成。本研究结果显示，木犀草素可通过PI3K/Akt信号通路促进BMSC成骨分化。碱性磷酸酶染色与茜素红S染色结果均显示，不同浓度木犀草素能够促进BMSC成骨分化，促进钙化结节形成。作为主要分布在细胞膜上，并在干细胞的成骨过程中前驱表达的钙结合转运蛋白，碱性磷酸酶是成骨细胞形成的重要标志[26]。本研究结果表明，与木犀草素0 μmol/L组比较，干预BMSC 7 d后，1 μmol/L与10 μmol/L木犀草素可明显促进碱性磷酸酶表达。钙化结节作为成骨分化的直接证明，本研究结果显示，BMSC在木犀草素的诱导下14 d即可出现钙盐沉积，且浓度越高钙盐沉积越多，说明成骨分化显著。PI3K/Akt是维持机体细胞正常生理活动的关键信号通路，其中Akt1作为PI3K的下游蛋白，可调节细胞增殖、生长和存活；激活PI3K/Akt信号通路后可通过抑制炎症细胞因子表达、减少细胞凋亡等，促进成骨细胞分化[20]。Western blot检测结果也显示，1 μmol/L与10 μmol/L木犀草素可促进PI3K、Akt1蛋白表达，且浓度越高效果越明显。以上结果均提示，PI3K、Akt1可能是木犀草素促进骨形成的靶点。综上所述，木犀草素可能通过激活PI3K/Akt信号通路，促进PI3K、Akt1蛋白的表达来发挥增强骨折端的血管形成及骨修复功能，这为木犀草素靶向治疗骨缺损和其他难以愈合的骨疾病提供了参考。但本研究也存在不足之处，未针对血管生成因子及对应通路进行深入探讨，尚待后续实验深入研究。