乳腺癌已超过肺癌成为全球第一大癌，严重威胁人类健康[1]。其中，雌激素受体（estrogen receptor，ER）阳性乳腺癌占比超过70%，是最主要的乳腺癌类型[2]。目前，内分泌治疗是ER阳性乳腺癌的主要治疗手段[3]，然而其治疗周期较长，且会引发血脂异常、关节疼痛、耐药性和心脏毒性等一系列不良反应[4―5]。据报道，白屈菜-元胡药对（Chelidonii Herba-Corydalis Rhizoma，以下简称“CHCR”）是肿瘤辅助治疗的常用药对之一，白屈菜、元胡常用剂量分别为15、15～30 g[6]。白屈菜为罂粟科植物白屈菜Chelidonium majus L.的干燥全草，味苦、性凉，具有镇痛、止咳、解毒之功效[7]。相关研究指出，白屈菜中的白屈菜碱可通过抑制p65核转位、抑制核因子κB信号转导而促进MCF-7细胞凋亡[8]；白屈菜红碱可通过调控磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）信号通路和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信号通路来抑制乳腺癌的发生发展[9]。元胡为罂粟科植物延胡索Corydalis yanhusuo W. T. Wang的干燥块茎，其性温、味辛苦，具有活血、利气、止痛之功效[7]。相关研究指出，元胡提取物可通过诱导活性氧生成和阻滞G2/M细胞周期来抑制MCF-7细胞的增殖[10]；其所含脱氢紫堇碱可通过调节B细胞淋巴瘤2（B cell lymphoma-2，Bcl-2）和Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）之间的比例来介导细胞凋亡，从而抑制MCF-7细胞的增殖[11]。可见，白屈菜、元胡具有明确的抗乳腺癌作用，笔者推测CHCR亦有抗乳腺癌作用。研究CHCR抗乳腺癌作用并阐明其作用机制，对于扩大药对的适用范围，以及指导中医临床乳腺癌的治疗具有较高的研究价值。基于此，本研究采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱（UPLC-Q-TOF-MS/MS）技术分析CHCR的化学成分，利用网络药理学方法筛选其治疗ER阳性乳腺癌的潜在作用靶点和通路并进行体外实验验证，以期为CHCR在乳腺癌临床治疗中的应用及相关药物的开发提供科学依据。1材料1.1主要仪器本研究所用主要仪器包括液相色谱-G6500系列四极杆飞行时间质谱联用仪（美国Agilent公司）、CO-150型二氧化碳培养箱（美国NBS公司）、iMark型酶标仪[伯乐生命医学产品（上海）有限公司]、DYCZ-24DN型电泳仪（北京六一生物科技有限公司）、ImageQuant LAS500型分子生物成像仪（GE通用电器医疗集团生命科学部）、Easy Cycler 96型聚合酶链式反应（PCR）仪（德国Biometra公司）、QuantStudioTM 1型实时荧光定量PCR仪[英潍捷基（上海）贸易有限公司]等。1.2主要药品与试剂实验所用白屈菜药材、醋制元胡饮片均购自哈尔滨三棵树中药材专业市场，经哈尔滨商业大学药学院曲中原教授鉴定分别为罂粟科植物白屈菜C. majus L.的干燥全草和罂粟科植物延胡索C. yanhusuo W. T. Wang的干燥块茎醋炙品。上述药材/饮片粉碎后，备用。白屈菜碱、延胡索乙素、原阿片碱、四氢黄连碱对照品（批号分别为DST220428-079、DSTDY010101、DSTD-Y011301、DSTDS015801，纯度均不低于98%）均购自成都德思特生物技术有限公司；长春新碱对照品（阳性对照，批号PCS-210402，纯度≥98%）购自北京中科质检生物技术有限公司；胎牛血清购自美国Gibco公司；RPMI 1640培养液购自大连美仑生物技术有限公司；BCA试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；兔源ERα、Akt、PI3K、β-肌动蛋白（β-actin）多克隆抗体（批号分别为L07130940、M04070003、M06243380、N09271372）均购自沈阳万类生物科技有限公司；兔源磷酸化PI3K（phosphorylated PI3K，p-PI3K）、磷酸化Akt（phosphorylated Akt，p-Akt）多克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗（批号分别为AG20900287、AE04205649、BJ08079044）均购自北京博奥森生物技术有限公司；PrimeScriptTM RT reagent kit with gDNA eraser试剂盒、TB GreenTM Premix Ex TaqTM 试剂盒（批号分别为RR047A、RR420A）均购自宝日医生物技术（北京）有限公司；甲醇、乙腈、甲酸均为分析纯，其余试剂均为分析纯或实验室常用规格，水为蒸馏水。1.3细胞人乳腺癌MCF-7细胞由哈尔滨商业大学药物工程技术研究中心提供。2方法2.1CHCR的成分分析2.1.1对照品溶液的制备精密称取白屈菜碱、延胡索乙素、原阿片碱、四氢黄连碱对照品各1 mg，分别加甲醇超声溶解并定容于5 mL容量瓶中，制成质量浓度均为0.2 mg/mL的对照品溶液，经0.22 μm微孔滤膜过滤，备用。2.1.2供试品溶液的制备称取白屈菜、醋制元胡粉末各5 g，加10倍量95%乙醇超声提取2 h，过滤；药渣以同法再提取1 h，过滤；合并2次滤液，浓缩，得浸膏（1 mg浸膏相当于15 mg生药）。取上述浸膏，加甲醇复溶并定容于25 mL容量瓶中，制成质量浓度为0.08 g/mL（以浸膏量计）的药对供试品溶液，经0.22 μm微孔滤膜过滤，备用。2.1.3色谱条件与质谱条件（1）色谱条件：以ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）为色谱柱，0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B）为流动相进行梯度洗脱（0～4 min，20%B；4～17 min，20%B→22%B；17～19 min，22%B→100%B；19～24 min，100%B→15%B）；流速为0.3 mL/min；柱温为30 ℃；检测波长为269 nm；进样量为0.2 μL。（2）质谱条件：采用电喷雾离子源进行正、负离子模式扫描；离子源温度为550 ℃；正负离子源电压分别为5 500、－4 500 V，裂解电压分别为80、－80 V；碰撞能分别为35、－35 eV，碰撞能扩展分别为15、 －15 eV；雾化气（gas1）压力为380 kPa，辅助气（gas2）压力为35 kPa，气帘气（curtain gas）压力为240 kPa。一级质谱母离子扫描范围为m/z 80～1 500；对信息依赖响应值超过100 cps的8个色谱峰进行二级质谱扫描，子离子扫描范围为m/z 50～1 500。2.1.4样品检测与数据处理取“2.1.2”项下供试品溶液，按“2.1.3”项下色谱与质谱条件进样分析，将采集结果导入MassHunter软件，通过化合物质谱裂解规律、准分子离子峰以及碎片离子信息与采集结果信息比对，对数据进行分析，列出检测到的峰强度以保留时间和产生的质量数据（m/z）对各峰进行标识，质量精确度小于10 ppm。相关化学成分信息通过PubMed、ChemSpider、Swiss Target Prediction、中国知网、中药系统药理数据库和分析平台（TCMSP）等数据库查询，具体信息包括成分名称、CAS号、化学结构、分子式及质谱裂解规律等。2.2CHCR抗ER阳性乳腺癌作用机制的预测将鉴定所得CHCR的化学成分分别输入TCMSP和Swiss Target Prediction数据库，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、类药性（drug-like properties，DL）≥0.18为标准筛选药对的活性成分[12]，同时纳入已报道的活性成分，在TCMSP和Swiss Target Prediction数据库中检索以获得CHCR成分靶点。借助GeneCards、OMIM、DrugBank数据库，以“estrogen receptor-positive breast cancer”为检索词，获取ER阳性乳腺癌的疾病靶点。采用Venny 2.1.0平台获得“成分-疾病”的交集靶点。将交集靶点输入至String 11.5数据库以获得靶点间相互作用关系，同时借助Cytoscape 3.8.2软件构建蛋白质-蛋白质互作（protein-protein interaction，PPI）网络。采用DAVID 6.8数据库进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，利用OmicShare平台进行数据可视化展示。最后，采用Cytoscape 3.8.2软件构建CHCR抗ER阳性乳腺癌作用的“活性成分-靶点-通路”关联网络。2.3CHCR抗ER阳性乳腺癌作用及机制验证2.3.1CHCR对MCF-7细胞的增殖抑制作用采用MTT法进行检测。取对数生长期的MCF-7细胞，按3×104个/mL接种于96孔板中，每孔100 μL。待细胞贴壁后，分别按终浓度0（即空白对照组）、0.062 5、0.125、0.25、0.5、1、2 mg/mL加入CHCR 95%乙醇提取物（制备方法同“2.1.2”项下）含药培养液（给药剂量依据预实验结果设置）；设置阳性对照孔，分别按终浓度0.125、0.25、0.5、1、2、4 μg/mL加入长春新碱含药培养液（给药剂量依据预实验结果设置）；同时设置不含细胞、不含药物的调零孔，每孔加入100 μL不含药培养液。每组设置6个复孔。培养48 h后，弃去培养液，加入0.5 mg/mL的MTT试剂100 μL；孵育4 h后，弃去上清液，每孔加入二甲基亚砜150 μL，避光振荡后，采用酶标仪于570 nm波长下测定各孔的吸光度值，计算细胞增殖抑制率和半数抑制浓度（IC50）。细胞增殖抑制率%＝（空白对照组平均OD值－给药组平均OD值）/空白对照组平均OD值×100%。实验重复3次。2.3.2CHCR对富集通路相关蛋白的影响采用Western blot法进行检测。取对数生长期的MCF-7细胞，随机分为空白对照组、阳性对照组（终浓度为0.5 μg/mL，剂量设置参考“2.3.1”项下结果）、CHCR组（终浓度分别为150、300、600 μg/mL，剂量设置参考“2.3.1”项下结果），每组设置6个复孔。其中，各药物组加入相应含药培养液100 μL，空白对照组加入等体积培养液。培养48 h后，收集各组细胞，用RIPA裂解缓冲液冰浴裂解，离心后收集蛋白，备用。以BCA法进行蛋白定量，将蛋白高温变性后行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳并转移至硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭2 h，分别加入Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K、ERα、β-actin一抗（稀释比例均为1∶1 000），在4 ℃下孵育过夜；加入相应二抗（稀释比例为1∶1 500），室温孵育2 h；利用ECL发光液显色，并置于分子生物成像仪下成像。应用Image J软件分析条带灰度值，以目的蛋白与内参蛋白（β-actin）条带灰度值的比值表示蛋白的表达水平。实验重复3次。2.3.3CHCR对MCF-7细胞中ESR1 mRNA表达的影响采用定量反转录PCR（quantitative reverse trans-criptase-mediated PCR，qRT-PCR）法进行检测。取对数生长期的MCF-7细胞，按“2.3.2”项下方法分组、给药。培养48 h后，收集各组细胞，提取细胞总RNA，再反转录为cDNA。以cDNA为模板，进行PCR扩增（引物序列和产物长度见表1）。反应体系为TB Green Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）（2X）10 μL、PCR Forward Primer（10 μmol/L）0.4 μL、PCR Reverse Primer（10 μmol/L）0.4 μL、ROX Reference Dye（50X）0.4 μL、DNA 模板 2.0 μL、灭菌水6.8 μL，共20 μL。扩增程序反应条件为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，共40个循环。以GAPDH为内参，采用2－ΔΔCt法计算ESR1 mRNA（ESR1为ERα的基因名）的相对表达量，实验重复3次。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.08.08.T001表1引物序列及产物长度基因引物序列产物长度/bpESR1上游引物：5′-TGCCCTACTACCTGGAGAACG-3′158下游引物：5′-TGCACAGTAGCGAGTCTCCTTG-3′163GAPDH上游引物：5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′101下游引物：5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′1012.4统计学方法采用SPSS 27.0软件对数据进行统计分析。数据以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。3结果3.1CHCR化学成分的鉴定采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术所得CHCR化学成分的总离子流图如图1所示。通过一级和二级质谱信息分析并结合相关文献，从CHCR中共鉴定出58个化学成分，有23个来自白屈菜，24个来自元胡，11个为二者共有成分；58个成分中，生物碱类成分有57个、有机酸类成分有1个，具体信息如表2所示。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.08.08.F001图1CHCR化学成分UPLC-Q-TOF-MS/MS分析的总离子流图10.6039/j.issn.1001-0408.2023.08.08.T002表2CHCR化学成分的鉴定分析结果峰号保留时间/min离子模式检测值m/z理论值m/z误差/ppm分子式特征碎片离子m/z鉴定结果归属代码b13.063[M+H]+328.154 8328.154 31.523 7C19H21NO4313.129 7，297.112 0，282.088 1，265.085 8，178.085 5去甲异紫堇啡碱元胡23.368[M]+342.170 4342.170 01.169 0C20H24NO4+327.149 0，297.112 4，282.086 3，237.091 5，209.080 1，191.086 9木兰花碱白屈菜33.564[M+H]+342.170 4342.170 01.169 0C20H23NO4327.149 0，297.112 4，282.086 3，237.091 5，209.080 1，191.086 9，176.069 0，165.068 3，137.060 2d-鹅掌楸啡碱元胡YH0443.627[M+H]+370.128 9370.128 51.080 7C20H19NO6352.118 5，321.076 1，303.065 5，263.070 2，235.075 5白屈菜明碱白屈菜54.638[M+H]+328.154 8328.154 31.523 7C19H21NO4314.175 7，265.080 9，178.086 4，164.069 9金黄紫堇碱共有GY0164.794[M+H]+328.154 8328.154 31.523 7C19H21NO4313.128 1，298.105 5，242.946 9，196.096 9异波尔定碱元胡YH0674.997[M+H]+342.170 4342.170 01.169 0C20H23NO4297.112 2，265.086 2，178.086 2，58.065 3四氢非洲防己碱共有GY0585.287[M+H]+342.170 4342.170 01.169 0C20H23NO4311.127 6，296.105 0，279.101 6，192.102 1唐松草坡芬碱元胡YH1595.452[M+H]+326.139 2326.138 71.533 1C19H19NO4277.085 2，233.114 2，208.971 8，178.086 3华紫堇碱白屈菜BQC05105.498[M+H]+336.086 9336.086 60.892 6C19H13NO5318.075 6，290.080 4，277.072 7，294.076 68-氧代黄连碱白屈菜BQC04115.914[M+H]+372.181 1372.180 51.612 1C21H25NO5354.169 7，323.125 3，292.104 8，208.095 5，190.084 9咖坡林碱元胡YH03126.142[M+H]+192.065 7192.065 51.041 3C10H9NO3192.066 1，174.053 5，149.059 3，119.049 3降氧化北美黄连次碱元胡136.439[M+H]+342.170 4342.170 01.169 0C20H23NO4327.149 0，297.112 4，282.086 3，237.091 5，209.080 1，191.086 9四氢药根碱共有146.612[M+H]+352.118 4352.117 91.420 0C20H17NO5327.147 1，310.130 4，294.124 7，265.123 7，192.101 9，178.086 3氧海罂粟碱元胡156.877[M+H]+356.186 3356.185 61.965 3C21H25NO4341.162 2，326.139 7，308.127 5，192.101 9d-海罂粟碱元胡166.988[M+H]+342.170 4342.170 01.169 0C20H23NO4327.145 6，312.125 1，294.125 9，262.605 6异紫堇定碱白屈菜BQC08177.136[M+H]+356.186 3356.185 61.965 3C21H25NO4341.161 0，310.142 8，281.050 2，253.109 4，192.101 9，165.090 8元胡菲碱元胡187.207[M]+322.108 0322.107 41.862 7C19H16NO4+307.083 8，279.087 6，249.077 4，205.096 5，172.016 613,14-二氢黄连碱白屈菜BQC02197.378[M+H]+356.186 3356.185 61.965 3C21H25NO4308.128 4，341.162 3，325.141 0，192.101 9延胡索乙素（右旋）a元胡YH10207.378[M+H]+356.186 3356.185 61.965 3C21H25NO4308.128 4，341.162 3，325.141 0，192.101 9延胡索乙素（左旋）a元胡YH14217.865[M+H]+370.128 9370.128 51.080 7C20H19NO6352.118 9，305.081 2，275.070 410-羟基白屈菜碱白屈菜228.005[M+H]+354.134 0354.133 61.129 5C20H19NO5336.123 4，323.091 4，305.081 1，275.070 3，247.075 4，206.081 2白屈菜碱a白屈菜BQC06238.506[M+H]+356.186 3356.185 61.965 3C21H25NO4314.162 5，327.160 3，312.158 5，294.121 7，206.117 0异紫菫鳞茎碱元胡YH11248.554[M+H]+354.134 0354.133 61.129 5C20H19NO5341.163 3，326.163 3，308.130 0，294.125 2原阿片碱a共有GY08259.235[M+H]+340.118 4340.117 91.470 1C19H17NO5323.091 5，305.081 3，275.070 4，189.071 5去甲基白屈菜碱白屈菜269.337[M+H]+370.165 3370.164 91.080 6C21H23NO5352.154 9，321.112 4，290.093 7，188.070 6隐品碱共有GY06279.525[M+H]+370.165 3370.164 91.080 6C21H23NO5352.154 7，321.112 6，290.093 2，206.081 4，188.070 7别隐品碱共有GY02289.571[M+H]+354.134 0354.133 61.129 5C20H19NO5336.123 5，323.092 1，305.081 5，275.070 5，192.102 28-羟基二氢白屈菜红碱白屈菜BQC03299.713[M+H]+356.186 3356.185 61.965 3C21H25NO4294.125 7，249.086 5，192.102 1，165.090 9异紫堇球碱元胡309.791[M+H]+354.134 0354.133 61.129 5C20H19NO5336.123 3，323.091 8，305.081 4，275.070 6异白屈菜碱白屈菜319.956[M+H]+328.191 5328.190 72.437 6C20H25NO3313.173 2，283.133 4，226.129 6，159.080 8，121.064 5狮足草碱元胡YH123210.050[M+H]+324.123 3324.123 00.925 6C19H17NO4307.096 6，295.097 6，249.091 0四氢黄连碱a共有GY103310.214[M+H]+338.139 3338.138 71.774 4C20H19NO4325.121 9，323.115 4，314.142 0，312.121 4去氢南天宁碱元胡3410.332[M+H]+324.123 3324.123 00.925 6C19H17NO4307.096 3，249.090 8，176.070 8，149.059 6金罂粟碱白屈菜BQC013510.574[M]+320.092 1320.091 71.249 6C19H14NO4+204.080 7，292.097 1，262.086 0，234.091 5黄连碱共有GY043610.716[M+H]+338.139 3338.138 71.774 4C20H19NO4323.115 4，308.092 4，294.112 4，280.096 6，265.072 5四氢刻叶紫堇明碱元胡YH133710.825[M+H]+320.092 1320.091 71.249 6C19H13NO4292.091 7，262.086 3，234.091 5，204.080 0，176.069 2岩黄连灵碱白屈菜3810.966[M]+338.139 3338.138 71.774 4C20H20NO4+294.112 8，265.986 8，239.970 4，162.980 7N-甲基金罂粟碱白屈菜3911.562[M+H]+370.165 3370.164 91.080 6C21H23NO5352.153 8，339.123 7，321.113 0，290.093 6，263.103 3，179.073 8高白屈菜碱白屈菜BQC074011.764[M+H]+340.155 1340.154 32.351 9C20H21NO4338.139 8，323.126 7，307.120 4，292.109 9d-南天竹啡碱元胡4111.992[M+H]+340.155 1340.154 32.351 9C20H21NO4325.132 5，308.100 8四氢小檗碱元胡YH014212.094[M+H]+354.170 6354.170 01.694 1C21H23NO4323.094 1，305.079 5，294.123 0去氢海罂粟碱元胡4312.314[M+H]+284.128 4284.128 11.055 9C17H17NO3269.087 9，251.030 9，239.238 8，224.042 2，147.043 9对羟基桂皮酸对羟基苯乙胺白屈菜BQC094412.502[M+H]+354.170 6354.170 01.694 1C21H23NO4339.144 5，323.123 0，190.086 1卡维丁元胡YH054513.308[M]+352.154 9352.154 31.703 8C21H22NO4+337.130 8，308.128 7，251.093 8，221.040 1，190.085 6去氢紫堇球碱元胡YH094613.895[M+H]+314.139 2314.138 71.591 7C18H19NO4253.953 5，194.081 5，177.054 8，121.064 6阿魏酸酰对羟基苯乙胺白屈菜BQC114714.248[M+H]+334.107 9334.107 41.496 5C20H15NO4319.085 0，306.110 7，291.090 6，263.096 0，217.926 8二氢血根碱共有GY074814.521[M+H]+334.107 9334.107 41.496 5C20H15NO4331.847 3，319.082 2，306.112 2，291.063 3去甲基白屈菜红碱白屈菜BQC104916.042[M+H]+366.134 3366.133 61.911 9C21H19NO5351.110 9，336.084 6，320.091 9，202.914 6，181.081 06-羟基二氢白屈菜红碱白屈菜5016.198[M+H]+366.134 3366.133 61.911 9C21H19NO5351.112 7，337.127 8，320.094 1，265.038 4，191.863 2紫堇洛星碱元胡YH075116.213[M+H]+352.154 9352.154 31.703 8C21H21NO4337.131 2，322.108 1，308.128 4，294.112 9，220.074 9N-甲基四氢小檗碱元胡YH085216.503[M]+336.123 7336.123 02.082 6C20H18NO4+323.105 6，321.093 3，318.075 5，304.097 0，292.080 4，321.099 8小檗碱共有GY035316.825[M+H]+368.113 4368.112 91.358 3C20H17NO6350.102 3，338.141 5，319.059 6，307.059 9，277.069 6荷包牡丹碱元胡YH025416.825[M+H]+368.113 4368.112 91.358 3C20H17NO6350.102 3，338.141 5，319.059 6，307.059 9，277.069 6氧化白屈菜碱白屈菜BQC125520.670[M+H]+392.113 6392.112 91.785 2C22H17NO6365.253 0，320.092 2，292.096 3，165.090 7，124.050 9spallidamine白屈菜BQC135621.132[M]+334.107 9334.107 41.496 5C20H16NO4+319.084 0，302.080 3，290.079 6，277.182 8紫堇萨明碱白屈菜5721.297[M+H]+348.123 3348.123 00.861 8C21H18NO4+333.099 6，318.099 6，304.096 9，290.081 2，260.070 9，246.091 1，232.075 5，204.078 9白屈菜红碱[13]白屈菜5821.360[M+H]+332.092 2332.091 71.505 6C20H14NO4+319.083 2，304.096 9，274.086 2，246.091 1血根碱共有GY09a：经对照品确认；b：后文“活性成分-靶点-通路”网络中各成分代码3.2CHCR抗ER阳性乳腺癌作用机制的预测结果3.2.1CHCR活性成分筛选及其成分靶点预测从“3.1”项下所鉴定出的58个化学成分中，筛选出38个活性成分，共得到成分靶点651个。3.2.2ER阳性乳腺癌疾病靶点的筛选结果在Gene Cards、OMIM、DrugBank 3个数据库中共获得疾病靶点1 593个；通过Venny 2.1.0平台获得“成分-疾病”交集靶点180个。3.2.3PPI网络的构建及核心靶点筛选对“3.2.2”项下“成分-疾病”交集靶点的PPI网络进行拓扑学分析，取大于2倍平均度值的靶点为核心靶点，共38个，包括ESR1、Akt1、磷酸肌醇3激酶调节亚单位1（phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 1，PIK3R1）等。3.2.4GO/KEGG富集分析及“活性成分-靶点-通路”网络的构建通过GO功能富集分析获得258个GO条目，包括171个生物过程条目、31个细胞组分条目、56个分子功能条目。其中，生物过程涉及信号转导、蛋白质磷酸化、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控等；细胞组分主要涉及胞浆、细胞核区域等；分子功能主要涉及蛋白激酶结合活性、腺嘌呤核苷三磷酸结合活性等。通过KEGG富集分析获得通路137条，与CHCR抗ER阳性乳腺癌作用密切相关的信号通路主要包括：雌激素信号通路（estrogen signal pathway）、PI3K/Akt信号通路（PI3K/Akt signal pathway）、红细胞癌基因B信号通路（ErbB signal pathway）等。进一步构建“活性成分-靶点-通路”网络，结果显示，CHCR所含同一化合物可作用于不同靶点，不同化合物也可作用于同一靶点，充分体现出CHCR多成分、多靶点的抗ER阳性乳腺癌机制，结果见图2。具体成分代号见表2。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.08.08.F002图2CHCR“活性成分-靶点-通路”网络图GY：白屈菜和元胡共有成分；BQC：白屈菜成分；YH：元胡成分3.3体外细胞实验验证结果3.3.1CHCR对MCF-7细胞的增殖抑制作用CHCR作用于MCF-7细胞48 h后，随着药物浓度的增加，细胞抑制率逐渐升高，有一定的浓度依赖趋势，结果见图3。CHCR作用于MCF-7细胞的IC50为693 μg/mL，长春新碱的IC50为0.528 μg/mL。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.08.08.F003图3CHCR对MCF-7细胞的增殖抑制作用（x±s，n＝6）3.3.2CHCR对PI3K/Akt通路相关蛋白表达的影响不同浓度的CHCR均可显著降低MCF-7细胞中p-PI3K、p-Akt蛋白的表达水平（P＜0.01），而对PI3K、Akt蛋白的表达水平均无明显影响（P＞0.05），结果见图4。这说明CHCR可抑制MCF-7细胞的PI3K/Akt信号通路，与网络药理学预测结果基本一致。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.08.08.F004图4CHCR对MCF-7细胞PI3K/Akt通路蛋白表达的影响a：与空白对照组比较，P＜0.05；b：与空白对照组比较，P＜0.013.3.3CHCR对雌激素信号通路的影响不同浓度的CHCR均可显著下调ERα蛋白的表达水平和ESR1 mRNA的表达水平（P＜0.01），结果见图5。这说明CHCR可以抑制MCF-7细胞中雌激素信号通路，结果与网络药理学预测结果基本一致。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.08.08.F005图5CHCR对MCF-7细胞ERα蛋白表达的影响a：与空白对照组比较，P＜0.014讨论在我国，中医药疗法已成为乳腺癌治疗的重要手段之一。CHCR传统水煎液的临床疗效明确，但药效物质基础尚不清楚。与水相比，乙醇对植物细胞的穿透能力较强，采用乙醇提取可获得更多的成分。基于此，本研究首先采用乙醇提取CHCR，再以UPLC-Q-TOF-MS/MS技术对该提取物的化学成分进行定性分析，初步鉴定出58个成分。其中，延胡索乙素可通过诱导细胞周期阻滞从而抑制ER阳性乳腺癌细胞的增殖[14]；小檗碱、白屈菜碱、白屈菜红碱也均具有良好的抗乳腺癌作用[15―17]。研究表明，雌二醇与ERα结合后，会激活ERα及其下游靶基因；PI3K/Akt信号通路的上调可诱导肿瘤细胞增殖，这两者都是ER阳性乳腺癌患者病情进展和转移的重要原因[18]。此外，有研究表明，ERα被雌二醇活化后，PI3K/Akt信号通路的活性被激活，说明ERα是PI3K/Akt信号通路的上游因子[19]。Akt抑制剂AZD5363作用于ER阳性乳腺癌细胞系可使其p-Akt和ERα蛋白表达下调[20]。这说明ERα-PI3K/Akt-ERα反馈通路的存在可能影响ER阳性乳腺癌的发生和发展。本研究发现，CHCR可抑制MCF-7细胞的增殖，下调ERα、p-PI3K、p-Akt蛋白的表达水平和ESR1 mRNA的表达水平，推测CHCR抗ER阳性乳腺癌的作用可能与调控ER和PI3K/Akt信号通路有关，这体现出CHCR多成分、多靶点的治疗机制，为其更好地应用于临床提供了科学依据。但本研究并未对富集获得的其他通路及机制进行验证，有待后续研究进一步完善。