阿托伐他汀（atorvastatin，ATV）是3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（DL-3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A disodium，HMG-CoA）的还原酶抑制剂，属于第3代他汀类药物。ATV能够显著降低胆固醇、低密度脂蛋白及三酰甘油水平，具有降脂作用强、药效维持时间长的优点，同时能够显著降低冠心病和其他心脑血管疾病的发生率及病死率，被广泛用于心血管疾病的预防和治疗，是目前使用最多、销量最大的他汀类药物[1]。但随着ATV的使用占比增加，由其引发的不良反应也逐渐增加，主要表现为转氨酶升高、药物性肝炎、肌痛、关节痛及横纹肌溶解等[1]。ATV以其活性酸的钙盐口服给药，绝对生物利用度约为14%[2]。生物利用度较低的原因在于进入体循环前肠道和肝脏的首过效应[2]。阿托伐他汀钙口服给药后，主要经由肝脏的细胞色素CYP3A4酶代谢为活性成分2-羟基阿托伐他汀酸（2-hydroxy atorvastatin acid，2-HAT）和4-羟基阿托伐他汀酸（4-hydroxy atorvastatin acid，4-HAT），在尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶的参与下转化为相应的非活性内酯衍生物，主要为阿托伐他汀内酯（atorvastatin lactone，ATL）[3]。活性成分与非活性内酯衍生物在体内可互相转换并保持平衡[4―5]。体外实验中，2-HAT和4-HAT对HMG-CoA还原酶的抑制作用与ATV相当，对HMG-CoA还原酶的循环抑制活性约70%是由活性成分代谢产物产生的[6―7]。与ATV比较，临床及近来的机制研究发现，ATL是ATV服用后发生肌肉毒性的主要因素[6―7]。因此，全面解析口服ATV后体内活性代谢产物和潜在毒性代谢产物ATL的暴露水平对于保障其疗效和安全性具有重要意义，特别是在与ATV的药物相互作用研究中，可更准确地预测合并用药隐患。尽管ATV已在临床广泛使用，考虑到临床研究成本，在临床前开展基于动物的药物相互作用评价仍是早期筛选及获得预警信息的重要手段。大部分关于ATV的药代动力学研究只针对大鼠血浆中原型及活性代谢产物进行了定量分析[8―9]，Ni等[10]报道了包含毒性代谢产物ATL的大鼠血药浓度，但是分析方法中未采用防止酸型和内酯型间的构型转换措施。因此，本研究旨在建立一种准确、快速、灵敏的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）检测方法，同时测定大鼠血浆中的ATV及其活性代谢产物2-HAT、4-HAT和毒性代谢产物ATL，并应用于药代动力学分析。1材料1.1主要仪器本研究所用主要仪器有API 4000 QTRAP型质谱系统（美国Applied Biosystem公司）、Agilent 1200型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）、DW-FL362型超低温冰箱（合肥长虹美菱股份有限公司）、MS205DU型电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）等。1.2主要药品与试剂ATV对照品（批号s.2077）购自美国Selleck Chemicals 公司；ATL对照品（批号5-JGC-56-5）、2-HAT对照品（批号7-VHP-82）、4-HAT对照品（批号1-TKA-22-2）均购自加拿大Toronto Research Chemicals公司；匹伐他汀（pitavastatin，PIV）对照品（批号H29A7B20167，内标）购自上海源叶生物科技有限公司，上述对照品纯度均不低于98%。阿托伐他汀钙片（批号EP8450，规格20 mg/片）购自辉瑞制药有限公司，质谱分析所用甲酸、甲醇和乙腈均为色谱纯，其余试剂均为分析纯。1.3实验动物SPF级雄性SD大鼠，体质量（200±10）g，购自北京维通利华生物技术有限公司，生产许可证号为SCXK（京）2019-0010，使用许可证号为SYXK（京）2019-0010。所有大鼠均饲养于中国中医科学院西苑医院动物室，温度（22±3）℃，相对湿度40%～70%，12 h明暗交替环境，自由进食、饮水，适应性饲养1周。动物实验经过中国中医科学院西苑医院动物伦理委员会批准，伦理批件号为2022XLC030-2。2方法与结果2.1色谱条件与质谱条件2.1.1色谱条件色谱柱为Agilent ZORBAX C18（2.1 mm×50 mm，5 μm），前置粒径为2 μm的在线滤器，柱温为30 ℃；流动相A相为水-甲醇-乙腈[9∶0.5∶0.5，（V/V/V），含0.05%甲酸]，B相为甲醇-乙腈[1∶1（V/V），含0.05%甲酸]，梯度洗脱（程序为0～0.3 min，48%B～100%B；0.3～1.6 min，100%B；1.6～5.0 min，48%B）；流速为0.35 mL/min；进样盘温度为4 ℃，进样量为4 μL。2.1.2质谱条件离子源为电喷雾离子源（electron spray ionization，ESI），正离子检测模式；气帘气体为20 psi；源内温度为500 ℃；源内气体GS1为40 psi，源内气体GS2为40 psi；离子喷射电压（IS）为5 000 V；碰撞气（CAD）为中（Medium）；扫描方式选择多反应监测（multi-reaction monitoring，MRM）模式，用于定量分析的各待测成分母离子和子离子及对应的去簇电压、碰撞电压和出口电压见表1。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.08.05.T001表1待测成分和内标的定量分析离子对及主要质谱参数待测成分/内标母离子m/z子离子m/z去簇电压/V碰撞电压/V出口电压/VATV559.3440.210631122-HAT575.2440.39133144-HAT575.0440.2913312ATL540.9448.2912514PIV422.2290.012139162.2溶液的制备2.2.1标准血浆样品精密称量ATV、PIV对照品各10 mg，ATL、2-HAT、4-HAT对照品各1 mg，分别加甲醇溶解后定容，制成质量浓度为1 mg/mL储备液。取不同体积的ATV、ATL、2-HAT和4-HAT储备液混匀，加甲醇稀释，得ATV和2-HAT浓度均为5 120 nmol/L、ATL和4-HAT浓度均为640 nmol/L的混合标准溶液。精密吸取空白大鼠血浆450 μL，加入50 μL混合标准溶液混匀作为标准曲线上限血浆样品，再以空白血浆逐级等比稀释2倍获得ATV、2-HAT、4-HAT和ATL的浓度范围分别为0.5～512、0.5～512、0.25～64、0.063～64 nmol/L的标准血浆样品。2.2.2质量控制样品取大鼠空白血浆，外加“2.2.1”项下的混合标准溶液，配制成ATV和2-HAT（浓度均为0.5、1、16、384 nmol/L）、4-HAT（浓度为0.25、0.5、4、48 nmol/L）、ATL（浓度为0.063、0.13、2、48 nmol/L）的质量控制（QC）样品。2.2.3内标溶液取PIV储备液，用甲醇稀释为25 ng/mL的内标溶液。2.3大鼠药代动力学实验及样品处理2.3.1给药及取材6只雄性SD大鼠，给药前禁食12 h，自由饮水。阿托伐他汀钙片与含2%二甲基亚砜、35%聚乙二醇400和2%吐温-80的纯净水混合溶解后，以10 mg/kg灌胃给药。于给药前和给药后0.08、0.33、0.67、1、2、4、6、8 h时从大鼠眼后静脉丛取血约0.15 mL，至预加肝素离心管中。大鼠在取血2 h后自由进水，4 h后自由进食。取出全血摇匀后马上放入冰盒中，在4 ℃、3 500 r/min下离心10 min，分离上层血浆，置于－35 ℃冰箱冻存待分析。2.3.2样本前处理冻存血浆样品在37 ℃下解冻，精密分取50 μL样品加入10%甲酸溶液2 μL，再加入内标溶液50 μL和乙腈150 μL，涡旋2 min，在12 000 r/min、4 ℃下离心5 min，分取上清液进样分析。2.4方法学考察2.4.1专属性取空白大鼠血浆50 μL，除用50 μL甲醇代替内标外，其余操作同“2.3.2”项下方法处理后，再按“2.1”项下条件进样分析。按“2.2.1”项下方法操作，配制ATV、ATL、2-HAT、4-HAT浓度分别为0.5、0.5、0.25、0.063 nmol/L的标准血浆样品，再按上述方法处理后进样分析。取“2.3.1”项下给药0.33 h后大鼠血浆样品，再按上述方法处理后进样分析。结果显示，ATV、ATL、2-HAT、4-HAT、PIV的保留时间分别为3.0、3.1、2.9、1.5、1.3 min，表明空白血浆的内源性物质不干扰ATV及代谢产物ATL、2-HAT、4-HAT及内标PIV的测定，且给药后生物样品和标准血浆样品在相同位置出峰，说明该分析方法对待测成分的分析专属性好。结果见图1。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.08.05.F001图1ATV及其3种代谢产物和内标的LC-MS/MS图谱2.4.2标准曲线、定量下限和检测限取“2.2.1”项下标准血浆样品按照“2.3.2”项下方法处理，再按“2.1”项下条件进样分析，每种浓度平行制备5份。以待测成分与内标的峰面积的比值为纵坐标（Y），待测成分浓度为横坐标（X）进行线性回归，权重因子为1/y2。线性回归分析结果显示，各待测成分线性关系良好（r＞0.99）。各待测成分的标准曲线、定量下限和检测限见表2。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.08.05.T002表2各待测成分的标准曲线、定量下限和检测限待测成分标准曲线r线性范围/（nmol/L）定量下限/（nmol/L）检测限（S/N＝3）ATVY＝0.020 9X+0.002 870.9960.5～5120.50.0302-HATY＝0.017 2X+0.002 360.9970.5～5120.50.0414-HATY＝0.011 0X+0.000 720.9980.25～320.250.052ATLY＝0.016 9X+0.000 770.9940.063～160.006 30.0152.4.3精密度和准确度取“2.2.2”项下的QC样品，按“2.3.2”项下方法平行制备6份样本，测定3 d，根据当日标准曲线，分别计算QC样品的测定浓度。以相对标准误差（RSD）来评价测定方法的批内和批间精密度，以相对误差（RE）来评价测定方法的准确度。ATV及其活性和毒性代谢产物的精密度和准确度见表3。高、中、低浓度的QC样品精密度和准确度RSD/RE均在15%以内，定量下限样品的精密度和准确度RSD/RE均在20%以内，说明所建立方法准确度和精密度良好。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.08.05.T003表3ATV及其活性和毒性代谢产物的精密度和准确度待测成分理论浓度/（nmol/L）实测浓度（x±s）/（nmol/L）精密度（n＝6）准确度RE（n＝6）/%批内精密度RSD/%批间精密度RSD/%ATV0.50.51±0.044.8917.492.0411.07±0.109.098.337.371616.06±0.915.222.175.72384421.72±20.074.754.829.822-HAT0.50.51±0.043.0719.011.6411.05±0.1210.4113.694.921616.03±0.734.171.724.58384414.50±22.925.674.297.944-HAT0.250.25±0.0416.2618.341.040.50.49±0.0510.054.55－1.7043.88±0.286.612.72－7.004849.72±2.8611.585.672.76ATL0.0630.06±0.0110.3118.16－3.100.130.13±0.0111.585.672.7621.95±0.166.914.85－7.924840.83±2.455.817.36－14.932.4.4回收率和基质效应采用6个不同个体来源空白血浆制备低、中、高浓度的QC样品，按照“2.3.2”项下方法分别处理空白血浆、水和QC样品。同时以处理后空白血浆或水配制浓度为1/5的低、中、高浓度的样品分别作为标准基质样品或标准溶液样品。按“2.1”项下方法测定各样品，通过各待测成分在QC样品与标准溶液样品中相应的内标归一化峰面积比值，计算回收率；通过各待测成分在标准基质样品与标准溶液样品中相应的内标归一化峰面积比值，计算基质效应。分析结果显示，所有待测成分的基质效应在86.8%～105.0%之间，个体间的RSD低于15%；回收率在88.0%～115.0%之间，个体间的RSD均低于15%。以上结果表明该分析方法的回收率较高，且基质效应不影响结果准确性。2.4.5稳定性在标准曲线范围内选择定量下限和低、中、高浓度，以大鼠空白血浆配制成相应QC样品，分别进行0时间点（配制后立即处理分析）、在室温下放置1 h、将处理后样品在进样器放置24 h、血浆样品放置于－80 ℃冰箱后反复冻融1次和3次以及－35 ℃冰箱储存1个月后处理分析（－35 ℃冰箱储存1个月稳定性样品中，高浓度样品为128 nmol/L），每一浓度5份样品。以随行标准曲线计算样品浓度，计算RSD及RE考察血浆样品放置稳定性。结果显示，ATV、2-HAT、4-HAT和ATL的不同浓度QC样品在以上条件下各待测成分均稳定，RSD均小于15%；ATV、2-HAT、4-HAT及ATL QC样品在上述各实验条件下的实测浓度的RE范围分别为－12.83%～14.45%、－10.27%～14.63%、 －11.96%～14.85%和－14.76%～14.79%（n＝5）。2.5ATV及其活性和毒性代谢产物在大鼠中的血药浓度及药代动力学分析采用“2.1”项下方法测定大鼠血浆中的ATV及其3种代谢产物的浓度，绘制血药浓度-时间曲线，见图2。由图2可知，给药后原型ATV迅速吸收入血，代谢产物也同时出现，其中，2-HAT的浓度在40 min后开始高于原型，成为血液循环中的主要形式。代谢产物4-HAT和ATL的暴露水平则远低于ATV和2-HAT。采用WinNonlin 6.1的非房室模型计算ATV及其代谢产物的药代动力学参数，见表4。由表4可知，2-HAT的峰浓度（Cmax）达ATV的1.6倍左右，而4-HAT和ATL仅约为ATV的1/7和1/150。原型ATV和代谢产物的消除半衰期（T1/2）均在1～2 h之间，2种活性代谢产物和原型ATV的消除半衰期接近，其中2-HAT消除略慢，而ATL消除最快。2-HAT的药-时曲线下面积（AUC0－∞）达ATV的3倍以上，而4-HAT和ATL的AUC0－∞约为ATV的1/5和1/160。ATV和ATL的达峰时间（Tmax）接近，均小于1 h，2种活性代谢产物的Tmax均在1～2 h之间。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.08.05.F002图2大鼠灌胃阿托伐他汀钙后血浆中ATV及其活性和毒性代谢产物的血药浓度-时间曲线（x±s，n＝6）10.6039/j.issn.1001-0408.2023.08.05.T004表4ATV及其活性和毒性代谢产物的药代动力学参数（x±s，n＝6）药代参数ATV2-HAT4-HATATLT1/2/h1.69±0.271.78±0.231.64±0.411.32±0.14Tmax/h0.73±0.132.00±0.001.45±1.360.57±0.24Cmax/（nmol/L）278.17±118.59458.83±121.1040.45±41.681.86±1.11AUC0－∞/（nmol·h/L）482.18±132.841 599.98±330.37101.99±98.782.99±0.89（CL/F）/[L/（kg·h）]18.10±4.07－－－（Vd/F）/（L/kg）44.62±13.35－－－CL/F：清除率；Vd/F：生物利用度校正的表观分布容积；－：无数据3讨论阿托伐他汀钙在体内的活性形式为阿托伐他汀酸，但是在体内酸式结构会在理化因素及酶的共同作用下与内酯型结构发生结构相互转换[11―12]。在方法学开发过程中尽可能避免构型间的转换是保障分析结果可靠性的重要条件。多个研究证明，内酯型结构在偏碱性环境下易转化为酸型结构，而弱酸性环境下转化率会极大降低[12―14]。本课题组在方法学开发过程中也发现，直接采用沉淀血浆蛋白法处理的样品，在样品架上放置，其ATV的内酯型代谢产物ATL的含量会因产生构型转换而下降明显。通过在血浆样品中加入一定量的甲酸溶液调节pH值至5～6之间，可保持提取后的样品在样品架稳定至少24 h。此外还应注意，在采血后立即将血浆样品放入冰盒并尽快离心冻存，以避免采血后各成分发生构型转化。已报道的测定ATV及其代谢产物分析方法多采用液液萃取的前处理方法，本研究采用一步沉淀法对样品进行处理，较液液萃取法极大地缩短了样品处理时间，同时也满足各待测成分的回收率均在85%～115%之间[8，15]的要求。采用已建立的方法开展药代动力学分析发现，ATV在大鼠体内迅速代谢，主要以邻位羟基酸型代谢物的形式暴露于体循环，内酯型代谢物浓度远低于其他成分。Gibson等[16]研究发现，健康年轻人体内ATL的暴露量和代谢率均低于高龄患者，可认为内酯型代谢物在人体内的代谢水平可能与年龄相关。本研究结果显示，成年健康大鼠ATV的内酯型代谢转化率较低，在大鼠体内是否存在类似的年龄引起的内酯代谢水平变化有待于进一步研究。与Ni等[10]发表的大鼠血药浓度以剂量归一化后对比，本研究的ATV和酸型代谢物浓度更高，而内酯型代谢物更低，这可能与本研究中的分析方法采取了有效的防止构型转化措施有关。本研究建立了同时测定大鼠血浆中ATV及其活性和毒性相关的3种代谢产物的LC-MS/MS分析方法。对分析方法的全面验证表明所建立的方法准确、快速和灵敏。通过运用该方法解析了单剂量ATV灌胃后原型药物及其各代谢产物在大鼠体内的药代动力学特征。对体内活性和毒性代谢产物的共同分析可应用于药物相互作用研究，评估合并用药对阿托伐他汀药效和安全性的影响。