目前，心血管疾病仍是造成人类死亡的主要原因之一，2019年全球约有1 860万人因心血管疾病死亡[1]。大多数心血管疾病的病因涉及心肌的病理性重构，而心肌纤维化是导致心肌病理性重构的重要原因之一[2―4]。虽然当前心肌纤维化的病因尚未完全明确，但炎症反应在心肌纤维化的发生、发展中起着关键作用[5―6]。细胞焦亡是由病原体相关分子或损伤相关分子激活、半胱氨酸蛋白酶1（caspase-1）介导的一种细胞炎性死亡，主要以细胞肿胀、细胞膜破裂、NOD样受体蛋白3（NOD-like receptor pyrin domain containing 3，NLRP3）为代表的炎症小体激活，细胞内容物和炎症介质释放为特征[7]。细胞焦亡的发生不仅会引起局部炎症反应，还会加重炎症反应[7]。本课题组前期研究发现，心肌成纤维细胞焦亡可加重心肌组织的纤维化[8―9]，而Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）作为NLRP3的上游调控因子，在焦亡的发生、炎症因子的释放中起着重要作用[10―11]，TLR4/NLRP3焦亡通路的激活可加剧心肌纤维化程度[12]。因此，通过抑制TLR4介导的细胞焦亡通路的激活可能起到抑制心肌纤维化的作用。红景天苷是中药红景天的重要组成成分，目前被证实对纤维化的发生、发展有明显的抑制作用[13―14]。实验研究显示，在内毒素引起炎症诱导的抑郁模型和巨噬细胞RAW264.7模型中，红景天苷抑制了TLR4蛋白的表达及相关炎症因子的释放[15―16]；此外，TLR4介导的细胞焦亡通路活化与炎症和心肌纤维化密切相关[17]。但红景天苷是否能通过TLR4/NLRP3焦亡通路抑制心肌组织焦亡，进而改善心肌纤维化目前尚不清楚。本实验使用异丙肾上腺素建立小鼠心肌纤维化模型，并使用红景天苷进行干预，探索红景天苷对小鼠心肌纤维化和焦亡的影响及潜在的作用机制，以期为红景天苷预防心肌纤维化提供实验参考。1材料1.1实验动物8周龄成年健康雄性SPF级C57BL/6小鼠50只，体质量（20±2） g，购自北京斯贝福生物技术有限公司，生产许可证号为SCXK（京）2019-0010。小鼠饲养于南京中医药大学附属中西医结合医院动物房，许可证号为SYXK（苏）2021-0025。饲养期间环境温度（24±1） ℃，相对湿度55%±10%，小鼠自由进食、饮水。1.2主要仪器Heraeus Megafuge 8R型高速离心机购自美国Thermo Fisher Scientific公司；MS203DU型电子天平购自瑞士Mettler-Toledo公司；Research Plus型微量移液器购自德国Eppendorf公司；Synergy H1型酶标仪、164-5051型双向电泳仪；7500型实时荧光定量PCR扩增仪、iBright CL750型Western blot显影仪均购自美国Applied Biosystems公司；IX73型显微镜购自日本Olympus公司。1.3主要药物与试剂红景天苷（货号WZY1006，纯度98%）购自陕西万植源生物科技有限公司；异丙肾上腺素（isoprenaline hydrochloride，ISO，批号H50020020）购自西南药业股份有限公司；戊巴比妥钠（货号P3761）购自美国Sigma公司；苏木素染液、伊红染液（货号分别为PH0516、PH0516）均购自福州飞净生物科技有限公司；Masson染色试剂盒、Sirius Red染色试剂盒（货号分别为BP-DL022、BP-DL030）和5%牛血清白蛋白溶液（5%BSA，货号BL-081）均购自南京森贝伽生物科技有限公司；TRIzol试剂（货号15596026CN）购自美国Thermo Fisher Scientific公司；RNA逆转录试剂盒（货号RR047A）购自日本Takara公司；SYBR Tag探针试剂盒（货号QPK-201）购自日本Toyobo公司；小鼠Ⅰ型胶原蛋白（collagen type Ⅰ，Col Ⅰ）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、TLR4、NLRP3、caspase-1、消皮素D（gasdermin D，GSDMD）、β-肌动蛋白（β-actin）的PCR引物均购自生工生物工程（上海）股份有限公司；兔源Col Ⅰ抗体（批号14695-1-AP）购自美国Proteintech公司；RIPA裂解液（批号P0013B）、BCA蛋白检测试剂盒（批号P0012）购自上海碧云天生物技术有限公司；兔源α-SMA抗体、兔源TLR4抗体、兔源NLRP3抗体、兔源caspase-1抗体、兔源GSDMD抗体、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的羊抗兔免疫球蛋白G（Ig G）二抗、HRP标记的羊抗小鼠IgG二抗（批号分别为#19245、#14358、#15101、#24232、 #39754、#7074、#7076）均购自美国CST公司；兔源甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体（批号ab181602）购自美国Abcam公司；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜购自美国Millipore公司；免疫组织化学试剂盒、DAB染色试剂盒（货号分别为SA1028、AR1022）均购自武汉博士德生物工程有限公司。2方法2.1分组、造模与给药将50只雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组、模型组和红景天苷低、中、高剂量组，每组各10只。除对照组外，其余各组小鼠皮下注射ISO 5 mg/（kg·d），连续注射14 d造模，所有小鼠均造模成功[18―20]。自造模之日起，红景天苷低、中、高剂量组小鼠每日灌胃红景天苷溶液10、30、50 mg/kg[21]，对照组和模型组小鼠每日灌胃生理盐水10 mL/kg，均连续灌胃14 d。2.2标本采集末次给药后，小鼠禁食、禁水24 h，腹腔注射2.5%戊巴比妥钠45 mg/kg麻醉。打开小鼠胸腔，取出心脏，分离多余的血管和脂肪等组织后，将心脏切半，一半心肌组织置于4%多聚甲醛中固定保存备用，另一半置于冻存管中－80 ℃冻存备用。2.3小鼠心肌组织病理变化的观察采用苏木素-伊红（HE）染色法。取出固定在4%多聚甲醛中的小鼠心肌组织，制成厚度约0.4 μm的石蜡切片，经烤片、脱水蜡化后进行HE染色、风干，在显微镜下观察并拍照。每个视野随机观察6个胞核居中的纵切面细胞，共随机观察20个视野。使用Image J软件测量心肌细胞横径，并计算平均值。2.4小鼠心肌组织纤维化程度的观察采用Masson染色法检测小鼠心肌间质中的胶原沉积情况，并观察心肌细胞形态和排列的改变。取“2.3”项下石蜡切片，按照试剂盒说明书进行Masson染色，在显微镜下观察并拍照。每张切片随机选取5个不重复视野，采用Image J软件计算心肌胶原容积分数（collagen volume fraction，CVF），CVF（%）＝心肌胶原面积/所测视野面积×100%。采用Sirius Red染色法进一步检测胶原纤维在小鼠心肌组织中的沉积情况。取“2.3”项下石蜡切片，经常规脱水蜡化、Sirius Red染色液滴染、蒸馏水清洗、苏木素染液染色、95%乙醇脱水、无水乙醇浸泡、二甲苯通透处理，最后用中性树胶封片，放通风橱风干后，在显微镜下观察并拍照。每张切片随机选取5个不重复视野，采用Image J软件计算CVF，计算方法同前。2.5心肌组织纤维化和焦亡相关指标mRNA表达的检测采用实时荧光定量PCR法检测。每组小鼠中随机取5只小鼠的心肌组织（冻存于－80 ℃）作为实验样本，使用TRIzol试剂按照说明书步骤提取总RNA。使用逆转录试剂盒，根据说明书合成cDNA。使用SYBR Tag探针试剂盒进行PCR。PCR程序如下：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸 30～34 s，40个循环。用PCR基因扩增仪分析反应结果，以β-actin为内参，采用2－ΔΔCt法计算每个心肌组织样本中Col Ⅰ、α-SMA、TLR4、NLRP3、caspase-1、GSDMD mRNA的表达水平。引物序列及产物长度见表1。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.09.06.T001表1PCR引物序列及产物长度基因引物序列（5′→3′）产物长度/bpCol Ⅰ上游引物：TGAACGTGGTGTACAAGGTC20下游引物：CCATCTTTACCAGGAGAACCAT22α-SMA上游引物：GCGTGGCTATTCCTTCGTGACTAC24下游引物：CGTCAGGCAGTTCGTAGCTCTTC23TLR4上游引物：GCCATCATTATGAGTGCCAATT22下游引物：AGGGATAAGAACGCTGAGAATT22NLRP3上游引物：GCCGTCTACGTCTTCTTCCTTTCC24下游引物：CATCCGCAGCCAGTGAACAGAG22caspase-1上游引物：AGAGGATTTCTTAACGGATGCA22下游引物：TCACAAGACCAGGCATATTCTT22GSDMD上游引物：CTAGCTAAGGCTCTGGAGACAA22下游引物：GATTCTTTTCATCCCAGCAGTC22β-actin上游引物：CTACCTCATGAAGATCCTGACC22下游引物：CACAGCTTCTCTTTGATGTCAC222.6心肌组织纤维化和焦亡相关指标蛋白表达及定位情况的检测采用Western blot法检测小鼠心肌组织中Col Ⅰ、α-SMA、TLR4、NLRP3、caspase-1、GSDMD总蛋白表达水平。取“2.5”项下每组同一批5只小鼠的心肌组织（冻存于－80 ℃）作为实验样本，放入配制好的RIPA缓冲液中裂解，裂解完成后高速离心，吸取上清液，根据BCA蛋白检测试剂盒说明书测定蛋白浓度，按照2 μg/μL的蛋白浓度配制上样体系。制备5%浓缩胶+10%分离胶，将样品按10 μL/孔上样。参照抗体说明书进行电泳、转膜、封闭、孵育相应一抗（Col Ⅰ、α-SMA、TLR4、NLRP3、caspase-1、GSDMD的稀释度均为1∶1 000，GAPDH的稀释度为1∶10 000，抗体稀释液为5%BSA）和二抗（稀释度均为1∶1 000），通过ECL显影液显影，使用Image J软件对蛋白条带进行量化处理，以目的蛋白与GAPDH（内参）条带灰度值的比值表示目的蛋白的总蛋白表达水平。采用免疫组织化学法检测纤维化和焦亡相关蛋白在小鼠心肌组织中的定位情况。取“2.5”项下每组同一批5只小鼠的心肌组织作为实验样本，经固定、切片、脱蜡、脱水处理后，用过氧化氢于37 ℃孵育30 min，以5% BSA于37 ℃恒温封闭1 h，向每个组织切片滴加50 μL配制好的一抗（Col Ⅰ、α-SMA、TLR4、NLRP3、caspase-1、GSDMD的稀释度分别为1∶300、1∶300、1∶50、1∶200、1∶200、1∶50），4 ℃孵育过夜，次日向各切片加入50 μL二抗，37 ℃孵育30 min。二抗孵育完成后向各切片加入50 μL SABC放大剂，37 ℃条件下加热20 min，以DAB显色、苏木素复染，脱水、透明、封片后在显微镜下观察，目的蛋白在胞质中呈棕褐色。每张切片随机选取5个放大倍数为100倍的视野拍照，并用Image J软件分析蛋白阳性细胞积分[22]，软件自带计算结果。表达相关目的蛋白的细胞染色后会出现棕褐色颗粒，棕褐色程度越深说明该细胞表达某目的蛋白水平越高。2.7统计学分析使用SPSS 24.0和GraphPad Prism 8.0软件进行统计学分析，计量资料以x±s表示，多组间比较采用方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。3结果3.1红景天苷对小鼠心肌组织病理变化的影响HE染色结果显示，与对照组比较，模型组小鼠心肌细胞间出现明显的炎性细胞浸润，心肌细胞体积明显增大，心肌纤维紊乱，细胞基质明显增加。与模型组比较，红景天苷中、高剂量组小鼠的炎性细胞浸润、心肌纤维紊乱、心肌细胞肥大、细胞基质增加程度均得到一定改善，红景天苷高剂量组效果更加明显。与对照组比较，模型组小鼠心肌组织中的心肌细胞横径显著增加（P＜0.01）；与模型组比较，红景天苷各剂量组小鼠的心肌细胞横径均显著减小（P＜0.05或P＜0.01）。结果见图1。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.09.06.F001图1各组小鼠心肌组织病理形态学观察显微图（HE染色，×100）及心肌细胞横径柱状图（x±s，n＝5）A～E：依次为对照组、模型组、红景天苷低剂量组、红景天苷中剂量组、红景天苷高剂量组显微图，箭头所指区域显示心肌细胞肥大、心肌纤维结构紊乱；F：心肌细胞横径柱状图；Ⅰ：对照组；Ⅱ：模型组；Ⅲ：红景天苷低剂量组；Ⅳ：红景天苷中剂量组；Ⅴ：红景天苷高剂量组；a：与对照组比较，P＜0.01；b：与模型组比较，P＜0.05；c：与模型组比较，P＜0.013.2红景天苷对小鼠心肌组织纤维化程度的影响Masson染色结合Sirius Red染色结果显示，对照组小鼠心肌细胞形态正常，细胞排列规则，胶原纤维沉积程度较低。与对照组比较，模型组小鼠心肌间质中大量胶原沉积，心肌细胞形态不规则、排列紊乱，2种染色方法得出的心肌组织中CVF均显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，红景天苷各剂量组小鼠心肌间质中胶原沉积程度减轻，心肌细胞排列较为规则，形态有所恢复，2种染色方法得出的心肌组织中CVF均显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。结果见图2。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.09.06.F002图2各组小鼠心肌组织纤维化Masson染色显微图 （×100）及CVF柱状图（x±s，n＝5）A～E：依次为对照组、模型组、红景天苷低剂量组、红景天苷中剂量组、红景天苷高剂量组显微图，箭头所指区域显示心肌胶原纤维堆积；F：CVF柱状图；Ⅰ：对照组；Ⅱ：模型组；Ⅲ：红景天苷低剂量组；Ⅳ：红景天苷中剂量组；Ⅴ：红景天苷高剂量组；a：与对照组比较，P＜0.01；b：与模型组比较，P＜0.05；c：与模型组比较，P＜0.013.3红景天苷对小鼠心肌组织纤维化和焦亡相关指标mRNA表达的影响与对照组比较，模型组小鼠心肌组织中Col Ⅰ、α-SMA、TLR4、NLRP3、caspase-1、GSDMD的mRNA 表达水平均显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，红景天苷高剂量组小鼠心肌纤维化相关指标Col Ⅰ、α-SMA的mRNA表达水平和焦亡相关指标TLR4、NLRP3、caspase-1、GSDMD的mRNA表达水平均显著降低（P＜0.05或P＜0.01）；红景天苷中剂量组小鼠α-SMA、caspase-1的mRNA表达水平也显著降低（P＜0.05）。结果见图3。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.09.06.F003图3各组小鼠心肌组织纤维化和焦亡相关指标mRNA表达水平的比较（x±s，n＝5）Ⅰ：对照组；Ⅱ：模型组；Ⅲ：红景天苷低剂量组；Ⅳ：红景天苷中剂量组；Ⅴ：红景天苷高剂量组；a：与对照组比较，P＜0.01；b：与模型组比较，P＜0.05；c：与模型组比较，P＜0.013.4红景天苷对小鼠心肌组织纤维化和焦亡相关指标蛋白表达及定位的影响Western blot结果显示，与对照组比较，模型组小鼠心肌组织中Col Ⅰ、α-SMA、TLR4、NLRP3、caspase-1、GSDMD的总蛋白表达水平均显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，红景天苷高剂量组小鼠心肌组织中Col Ⅰ、α-SMA、TLR4、NLRP3、caspase-1、GSDMD的总蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05或P＜0.01）；红景天苷低剂量组小鼠心肌组织中α-SMA和红景天苷中剂量组小鼠心肌组织中α-SMA、TLR4的总蛋白表达水平也显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。结果见图4、图5。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.09.06.F004图4各组小鼠心肌组织纤维化和焦亡相关指标蛋白表达电泳图Ⅰ：对照组；Ⅱ：模型组；Ⅲ：红景天苷低剂量组；Ⅳ：红景天苷中剂量组；Ⅴ：红景天苷高剂量组10.6039/j.issn.1001-0408.2023.09.06.F005图5各组小鼠心肌组织纤维化和焦亡相关指标总蛋白表达水平的比较（x±s，n＝5）Ⅰ：对照组；Ⅱ：模型组；Ⅲ：红景天苷低剂量组；Ⅳ：红景天苷中剂量组；Ⅴ：红景天苷高剂量组；a：与对照组比较，P＜0.01；b：与模型组比较，P＜0.05；c：与模型组比较，P＜0.01免疫组织化学结果显示，与对照组比较，模型组小鼠心肌细胞胞质中纤维化和焦亡相关蛋白的表达明显增加，心肌组织中Col Ⅰ、α-SMA、TLR4、NLRP3、caspase-1、GSDMD的蛋白阳性细胞积分均显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，红景天苷高剂量组小鼠心肌细胞胞质中纤维化和焦亡相关蛋白的表达明显降低，心肌组织中Col Ⅰ、α-SMA、TLR4、NLRP3、caspase-1、GSDMD的蛋白阳性细胞积分均显著降低（P＜0.01）；红景天苷低剂量组小鼠心肌组织中Col Ⅰ、α-SMA、TLR4和红景天苷中剂量组小鼠心肌组织中Col Ⅰ、α-SMA、TLR4、caspase-1、GSDMD的蛋白阳性细胞积分也显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。结果见图6、图7。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.09.06.F006图6各组小鼠心肌组织纤维化和焦亡相关指标蛋白的定位情况和表达水平的比较（DAB染色，×100）注：棕褐色程度越深，代表蛋白表达水平越高；红景天苷低、中剂量组图略10.6039/j.issn.1001-0408.2023.09.06.F007图7各组小鼠心肌组织纤维化和焦亡相关指标蛋白阳性细胞积分柱状图（x±s，n＝5）Ⅰ：对照组；Ⅱ：模型组；Ⅲ：红景天苷低剂量组；Ⅳ：红景天苷中剂量组；Ⅴ：红景天苷高剂量组；a：与对照组比较，P＜0.01；b：与模型组比较，P＜0.05；c：与模型组比较，P＜0.014讨论心肌纤维化是众多心脏疾病的病理表现，表现为心肌细胞的病理性重构和纤维化瘢痕的产生，导致心肌僵硬程度增加、心肌顺应性和射血分数降低，出现多种心脏功能障碍，如高血压性心肌肥厚、心肌病、心肌梗死等，甚至死亡[23]。因此，探讨心肌纤维化的发病机制及改善心肌纤维化是目前的重要研究方向。α-SMA和Col Ⅰ是心肌纤维化发生、发展过程中的重要标志物[24―25]。细胞焦亡是一种依赖caspase和GSDMs蛋白家族并伴有大量促炎性因子释放的程序性细胞死亡方式。细胞焦亡所产生的NLRP3炎症小体是一种可维持成纤维细胞促纤维化表型、促进胶原蛋白沉积的胞质蛋白复合物，同时还可使休眠的caspase-1酶原被水解切割成活跃的caspase-1[26―27]。caspase-1作为一种半胱氨酸蛋白酶可切割GSDMD，切割后产生的GSDMD蛋白氮端水解片段可促进焦亡的发生[28―29]。TLR4是一种在细胞表面表达的Ⅰ型跨膜蛋白，可识别不同的病原体相关分子模式。在小鼠巨噬细胞焦亡模型中，TLR4可通过调控NLRP3的表达来抑制焦亡的发生[17]。同时也有研究提示，抑制TLR4/NLRP3通路可缓解心肌缺血/再灌注损伤引起的焦亡[30]。本实验采用ISO诱导建立小鼠心肌纤维化模型，通过HE、Masson、Sirius Red染色进行病理学观察，结果表明，与对照组比较，模型组小鼠表现出明显的心肌纤维化，心肌细胞体积增大，心肌纤维排列紊乱，细胞基质明显增加，心肌组织中CVF显著升高；与此同时，模型组小鼠心肌组织中Col Ⅰ、α-SMA、TLR4、NLRP3、caspase-1、GSDMD蛋白的表达水平均显著高于对照组，其mRNA表达水平也有同样的趋势。这提示心肌组织纤维化和心肌组织的焦亡发生有一定关联。中医药治疗心肌纤维化是目前临床重要的补充方法，红景天苷作为中药红景天的重要成分，已被证实能够治疗心脏疾病和纤维化疾病[13―14]，但红景天苷对心肌纤维化及TLR4介导的焦亡通路激活的研究报道甚少。本实验中，与模型组比较，经红景天苷治疗的小鼠心肌纤维化程度明显减轻，心肌细胞外基质减少，心肌细胞排列较为规则；红景天苷中、高剂量组小鼠心肌组织中纤维化和焦亡相关指标（Col Ⅰ、α-SMA、TLR4、NLRP3、caspase-1、GSDMD）的mRNA表达水平、总蛋白表达水平、蛋白阳性细胞积分均不同程度降低，且均以高剂量组下降程度最为显著。此外，红景天苷低剂量组部分纤维化和焦亡相关指标也在一定程度上逆转。以上结果提示红景天苷可抑制TLR4介导的焦亡通路活化引起的心肌纤维化。综上所述，红景天苷对心肌纤维化的发生、发展有明显的预防作用，其机制可能是通过抑制TLR4介导的心肌细胞焦亡通路激活，但其在心肌组织中对TLR4的具体作用机制尚不清楚，有待进一步研究。