肿节风为金粟兰科植物草珊瑚Sarcandra glabra （Thunb.） Nakai 的干燥全草，具有清热凉血、活血消斑、祛风通络等功效，临床上主要用于治疗肿瘤、炎症及紫癜等疾病，主要含黄酮类、倍半萜类、香豆素类、有机酸类等活性成分[1―2]。2020年版《中国药典》（一部）规定以迷迭香酸、异嗪皮啶含量作为肿节风药材的质量评价指标[1]。研究显示，迷迭香酸具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、免疫调节、抗血栓和抗血小板凝聚等作用[3]；异嗪皮啶具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化、心脏保护和神经保护等作用[4]。现阶段对肿节风药材中迷迭香酸或异嗪皮啶提取方法的研究主要以回流提取和超声提取为主，但多见于单种成分的提取[5―7]，对于同时提取两种成分的方法除《中国药典》规定的加热回流提取外，目前暂未发现其他更优提取方法。迷迭香酸易溶于水、乙醇、甲醇，难溶于氯仿、乙醚、无水乙醇等，易氧化，且超过60 ℃时易降解[8]。相关研究发现，用甲醇提取迷迭香酸的得率更高，且更稳定[9―11]。另外，异嗪皮啶易溶于热甲醇、乙醇、氯仿[5]。因此，为缩短肿节风药材中迷迭香酸和异嗪皮啶的提取时间，笔者采用超声提取法，并以甲醇为提取溶剂；然后利用熵权法结合Box-Behnken响应面法考察超声时间、超声温度、液料比及甲醇体积分数对两者综合提取的影响，以期为肿节风药材的提取工艺提供参考。1材料1.1主要仪器本研究所用主要仪器有Waters 2695型高效液相色谱仪（美国Waters公司），SCQ-5201F型超声波清洗器（上海声彦超声波仪器有限公司），AB135-S型十万分之一电子天平（瑞士Mettler Toledo公司），TDL-80-2C型低速离心机（上海安亭科学仪器有限公司）。1.2药物与试剂肿节风药材为本课题组野外采集，经自然阴干后密封保存，经江西中医药大学药学院刘勇教授鉴定为金粟兰科植物草珊瑚S. glabra （Thunb.） Nakai的干燥全草。迷迭香酸对照品（批号111871-202007，纯度＞98%）、异嗪皮啶对照品（批号110837-201608，纯度100%）均购自中国食品药品检定研究院；乙腈、磷酸为色谱纯，甲醇为分析纯，水为娃哈哈纯净水。2方法与结果2.1肿节风药材中迷迭香酸、异嗪皮啶含量测定方法的建立2.1.1色谱条件色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液（20∶80，V/V）；流速为1.0 mL/min；柱温为35 ℃；检测波长为342 nm；进样量为10 μL。2.1.2对照品溶液的制备分别精密称定迷迭香酸4 mg、异嗪皮啶3.5 mg，置于5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，即得迷迭香酸、异嗪皮啶质量浓度分别为0.8、0.7 mg/mL的单一对照品溶液。精密吸取各单一对照品溶液1 mL，置于5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，即得混合对照品溶液。2.1.3供试品溶液的制备精密称定肿节风药材粉末0.5 g（过三号筛），置于具塞锥形瓶中，加入一定体积分数甲醇25 mL，密塞，称定质量；在一定条件下超声提取，放冷，再称定质量；用相同体积分数甲醇补足减失的质量，摇匀，以13 000 r/min 离心10 min，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。2.1.4线性关系考察精密吸取混合对照品溶液2、4、6、8、10 μL进样分析，以峰面积（Y）为纵坐标，以进样量（X/μg） 为横坐标，绘制标准曲线。结果显示，迷迭香酸与异嗪皮啶的回归方程分别为Y＝2 492 576.666 7X－904 910.333 3（R2＝0.999 6）、Y＝3 209 458.244 9X－ 1 324 374.200 0（R2＝0.999 6），线性范围分别为0.32～1.60、0.28～1.40 μg。2.1.5精密度试验取混合对照品溶液适量，按“2.1.1”项下色谱条件连续进样6次，记录各成分峰面积。结果显示，迷迭香酸、异嗪皮啶峰面积的RSD分别为1.82%、0.87%（n＝6），表明仪器精密度良好。2.1.6稳定性试验取“2.1.3”项下供试品溶液于室温放置0、2、4、8、12、24 h时，按“2.1.1”项下色谱条件进样分析，记录峰面积。结果显示，迷迭香酸、异嗪皮啶峰面积的RSD分别为1.01%、1.27%（n＝6），表明供试品溶液在室温放置24 h内稳定。2.1.7重复性试验取肿节风药材粉末0.5 g，共6份，分别按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，按外标法计算含量。结果显示，迷迭香酸、异嗪皮啶的平均含量分别为5.102 2、2.131 0 mg/g，RSD分别为1.62%、1.37%（n＝6），表明该方法重复性良好。2.1.8加样回收率试验精密称取已知迷迭香酸、异嗪皮啶含量的肿节风药材粉末0.5 g，共6份，分别精密加入一定量混合对照品溶液，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算加样回收率。结果显示，迷迭香酸、异嗪皮啶的平均加样回收率分别为99.76%、101.42%，RSD分别为1.09%、0.89%（n＝6），表明该方法准确可行。2.2肿节风药材中迷迭香酸、异嗪皮啶提取参数的单因素考察实验精密称取肿节风药材粉末0.5 g，考察超声时间、超声温度、液料比（mL/g）、甲醇体积分数对迷迭香酸、异嗪皮啶提取的影响，按照“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1.1”项下色谱条件进行分析。2.2.1超声时间考察在甲醇体积分数100%、液料比50∶1（mL/g）、超声温度45 ℃条件下，按“2.1.1”项下色谱条件分别考察超声时间20、30、40、50、60 min对迷迭香酸、异嗪皮啶含量的影响。由图1A可知，随着超声时间的延长，迷迭香酸的含量逐渐升高，在20～40 min内增长幅度较大，在40～60 min内增长幅度较小；异嗪皮啶含量随超声时间的延长呈先升高后降低的趋势，但变化范围较小，在40 min附近达到最大值。经综合考虑后，选择超声时间30～50 min进行Box-Behnken响应面实验。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.09.09.F001图 1单因素实验考察结果2.2.2超声温度考察在甲醇体积分数100%、液料比50∶1（mL/g）、超声时间40 min条件下，按“2.1.1”项下色谱条件分别考察超声温度30、40、45、50、60 ℃对迷迭香酸、异嗪皮啶含量的影响。由图1B可知，随着超声温度的增加，迷迭香酸含量在45 ℃附近达到最大值；异嗪皮啶含量呈先升高后降低的趋势，但含量变化范围较小，在45 ℃附近达到最大值。经综合考虑后，选择超声温度40～50 ℃进行Box-Behnken响应面实验。2.2.3液料比考察在甲醇体积分数100%、超声时间40 min、超声温度45 ℃条件下，按“2.1.1”项下色谱条件分别考察液料比20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1（mL/g）对迷迭香酸、异嗪皮啶含量的影响。由图1C可知，迷迭香酸含量在液料比20∶1～30∶1下呈下降趋势，而后呈先升高后降低的趋势；异嗪皮啶含量呈先升高后降低的趋势，两者均在液料比50∶1附近达到最大值。经综合考虑后，选择液料比40∶1～60∶1进行Box-Behnken响应面实验。2.2.4甲醇体积分数考察在超声时间40 min、超声温度45 ℃、液料比50∶1（mL/g）条件下，按“2.1.1”项下色谱条件分别考察甲醇体积分数60%、70%、80%、90%、100%对迷迭香酸、异嗪皮啶含量的影响。由图1D可知，迷迭香酸含量随着甲醇体积分数增大，呈先升高再降低，而后缓慢升高再降低的趋势；异嗪皮啶含量随着甲醇体积分数升高，呈先升高后降低的趋势，但其含量变化范围较小，在甲醇体积分数70%时达到最大值。经综合考虑后，选择甲醇体积分数60%～80%进行Box-Behnken响应面实验。2.3Box-Behnken响应面法优化肿节风药材的提取工艺2.3.1Box-Behnken响应面法实验设计及结果在单因素实验结果基础上，以迷迭香酸、异嗪皮啶含量的综合评分为评价指标，以超声时间（A）、超声温度（B）、液料比（C）、甲醇体积分数（D）为影响因素，采用4因素3水平Box-Behnken响应面法进行实验。迷迭香酸、异嗪皮啶含量的综合评分采用熵权法进行计算[10―12]，首先建立原始评价指标矩阵（Xij）mn，对数据进行归一化处理后建立概率矩阵Pij；其次，计算各指标信息熵（Eij）及权重系数（Wj）；然后，得迷迭香酸和异嗪皮啶的Wj分别为0.311 3、0.988 6，再根据Wj计算综合评分（M）[13]，M＝迷迭香酸含量/迷迭香酸含量最大值×0.311 3+异嗪皮啶含量/异嗪皮啶含量最大值×0.988 6。Box-Behnken响应面法实验因素与水平见表1，方案与结果见表2。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.09.09.T001表 1Box-Behnken响应面法实验设计因素与水平水平A/minB/℃C/（mL/g）D/%－1304040∶1600404550∶1701505060∶18010.6039/j.issn.1001-0408.2023.09.09.T002表2Box-Behnken响应面法设计实验方案与结果序号A/minB/℃C/（mL/g）D/%迷迭香酸/（mg/g）异嗪皮啶/（mg/g）M1505050∶1705.145 42.129 60.9552404060∶1704.938 62.150 00.9503304050∶1705.201 42.102 20.9494405050∶1605.000 22.111 00.9415404540∶1804.961 61.734 00.8206304540∶1704.773 81.736 40.8107404550∶1705.489 22.159 40.9838404550∶1705.680 22.179 80.9999305050∶1704.933 22.103 60.93510304550∶1604.827 02.137 80.94011404040∶1704.762 81.736 20.81012404050∶1604.587 02.117 60.92013404540∶1604.200 01.739 60.78014404550∶1705.408 42.158 80.97915405060∶1705.450 42.109 80.96516404560∶1605.094 22.139 00.95517404050∶1804.820 62.150 00.94318405050∶1804.802 22.142 00.94019304550∶1804.770 02.147 80.94020405040∶1704.745 01.771 60.82021304560∶1705.216 62.120 00.95622504050∶1704.969 02.110 40.93923504540∶1705.161 41.802 20.85224504550∶1805.104 22.148 00.95825404560∶1804.773 42.120 00.93126404550∶1705.479 22.171 60.98627504550∶1604.808 22.121 40.93328504560∶1705.009 42.119 80.94429404550∶1705.400 02.160 20.9782.3.2模型拟合与方差分析采用Design-Expert 13软件对表2实验结果进行回归拟合分析，以A、B、C、D为自变量，以M为响应值，得到二次多项回归拟合方程M＝0.985 1+0.004 4A+0.003 7B+0.067 5C+0.005 3D+0.007 5AB+0.013 4AC+0.062 0AD+0.001 3BC+0.006 0BD+0.015 9CD+0.015 5A2+0.021 1B2+0.080 4C2+0.029 2D2；对模型方程进行方差分析，结果见表3。由表3可知，模型P＜0.05，失拟相P＝0.576 1，模型显著，失拟相不显著，表明未知因素对实验影响较小，可用该模型对实验结果进行预测。模型相关系数R2＝0.989 9，调整后R2＝0.979 8，变异系数＝0.953 7，表明模型的模拟程度良好，方法可靠[12]。一次项C与交互项AC、CD为显著项，表明C对M影响显著；A与C、C与D交互作用显著，由于FC＞FD＞FA＞FB，故4个因素对综合评分的影响程度依次为C＞D＞A＞B。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.09.09.T003表3回归模型的方差分析结果项目平方和自由度均方FP模型0.101 1140.007 298.04＜0.000 1A0.000 210.000 23.120.099 1B0.000 210.000 22.200.160 1C0.054 710.054 7742.83＜0.000 1D0.000 310.000 34.510.052 1AB0.000 210.000 23.040.103 4AC0.000 710.000 79.720.007 6AD0.000 210.000 22.070.172 0BC0.000 006 7610.000 006 760.091 80.766 3BD0.000 110.000 11.990.180 3CD0.001 010.001 013.740.002 3A²0.001 510.001 621.050.000 4B²0.002 910.002 939.25＜0.000 1C²0.041 910.041 9569.62＜0.000 1D²0.005 510.005 575.30＜0.000 1残差0.001 0140.000 1失拟相0.000 7100.000 10.940.576 1纯误差0.000 340.000 1总差0.102 1282.3.3回归模型的Box-Behnken响应面分析利用Design-Expert 13软件对模型方程进行Box-Behnken响应面分析，得到等高线图及响应面图，结果见图2。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.09.09.F002图2各因素对肿节风药材中迷迭香酸与异嗪皮啶含量综合评分的影响由图2可知，超声时间与液料比、超声温度与液料比的交互作用更强，其等高线图更趋向于椭圆，响应面图也更陡峭，表明超声时间与液料比、超声温度与液料比对综合评分的交互影响更显著，其中液料比响应面图较超声温度、超声时间更陡峭，表明液料比对提取工艺综合评分的影响更大。根据模型拟合结果，预测出肿节风药材最佳提取工艺为超声时间40.211 min，超声温度45.741 ℃，液料比 54.575∶1，甲醇体积分数70.081%。进一步根据实际操作调整最佳提取工艺为超声时间40 min，超声温度45 ℃，液料比50∶1，甲醇体积分数70%。2.3.4肿节风药材提取工艺的验证实验按最佳提取工艺重复进行3次验证实验。结果显示，3次验证实验的平均综合评分为0.988 6，RSD为0.50%，表明建立的肿节风药材提取工艺稳定、重复性好；各综合评分实际值与Box-Behnken响应面法所得预测值（0.985 1）之间的偏差均在±1%以内，表明该模型预测性良好。结果见表4。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.09.09.T004表4肿节风提取工艺的验证结果批次迷迭香酸/（mg/g）异嗪皮啶/（mg/g）综合评分15.463 82.166 20.983 125.621 22.159 20.990 235.584 22.174 20.992 6平均值5.556 42.166 50.988 6RSD/%1.480.350.503讨论在中药提取过程中，提取工艺将会直接影响其中有效成分的提取率，这些工艺包括提取方法、提取溶剂、提取时间、提取温度、液料比、提取次数、浸泡时间等。肿节风药材含有多种化学成分，对于不同的化学成分，往往具有不同的提取方法，合适的提取方法不仅能有效节约药材资源，也可极大提升药材质量与生产效率。Box-Behnken响应面法是一种可有效、快速、精确优化工艺条件的方法，相比于常用的正交设计和均匀设计方法，Box-Behnken响应面法可进行连续分析，找出最合适的条件，得到精度高的回归方程，并能反映各因素之间的交互作用[13―14]。熵权法是一种可用于多对象、多指标的综合评价法，可避免人为因素导致的干扰，使实验结果精确度高、客观性强[15]。因此，笔者综合考虑肿节风药材中迷迭香酸与异嗪皮啶的含量，利用熵权法对Box-Behnken响应面法设计结果赋予权重系数，计算迷迭香酸与异嗪皮啶的综合评分。结果显示，肿节风药材最佳提取工艺参数为超声时间40 min，超声温度45 ℃，液料比50∶1，甲醇体积分数70%。进一步进行3次验证实验发现，模型预测性良好。综上所述，本研究优化后的工艺稳定可行、重复性好，可为肿节风药材的提取提供参考。