膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是一种以膝关节疼痛、压痛、肿胀、僵硬不适、活动受限等为主要临床表现的慢性退行性疾病，常发生于老年人群[1]。关于KOA，国内外学者比较公认的病理特征是以膝关节软骨损伤、退化，间隙变宽、骨小梁断裂为主，伴骨质增生、滑膜炎等病变，疾病晚期可导致膝关节畸形，引起肢体残疾[2]。晚期KOA因病损严重，软骨出现严重退行性病变，保守治疗已无明显效果，此时多采用膝关节手术进行治疗。目前对早中期KOA的治疗多以抗炎、镇痛为主，以达到缓解疼痛、控制病情发展的目的[3]。双醋瑞因是近年来治疗骨关节炎的一种蒽醌类新型药物，可抑制白细胞介素1（interleukin-1，IL-1）分泌，具有镇痛、抗炎、诱导软骨生成从而修复软骨组织的作用[4]。但临床单一采用双醋瑞因治疗KOA虽能延缓病程，镇痛效果却不理想[5―6]。鸡胚地龙贴膏是运用我国水族医药独特理论研制而成的外用制剂（批件号：黔药制备字Z20220014000号），处方由鸡胚、地龙、续断、骨碎补、透骨香、水冬瓜根皮、栀子、虎杖、制马钱子、冰片10味中药材组成，具有活血化瘀、消肿止痛、舒筋通络的功效，适用于气滞血瘀引起的关节及周围软组织疼痛、红肿，常用于治疗KOA、类风湿关节炎等，尤其在镇痛、抗炎方面优势明显[7—8]。鉴于此，本研究拟采用鸡胚地龙贴膏联合双醋瑞因治疗早中期KOA患者，观察其临床效果及安全性，以期寻找治疗早中期KOA新的方法及疗效评估靶点。1资料与方法1.1纳入、排除与脱落标准本研究的纳入标准为：（1）符合《骨关节炎诊治指南（2018年版）》诊断标准[2]，并伴有下列4项或4项以上症状者——①近几个月大多数时间有膝痛；②膝关节活动时有骨摩擦音；③晨僵时间小于或等于30 min；④年龄大于或等于40岁；⑤膝关节有骨膨大；⑥关节炎检查结果为骨性关节炎；⑦X线检查有骨赘形成。（2）符合骨关节炎X线Kellgren-Lawrence分级（以下简称“X线分级”）标准0～Ⅲ级——①0级：正常（无改变）；②Ⅰ级：关节间隙正常，轻微骨赘；③Ⅱ级：关节间隙可疑变窄，明显骨赘，但未累及关节腔；④Ⅲ级：关节间隙轻度或中度狭窄，中等量骨赘，有硬化性改变。（3）符合KOA进展分期的早中期标准[4]——①早期：病变膝关节疼痛，触诊无摩擦感、滑膜无肥厚感，X线检查见骨赘或骨硬化，但关节间隙正常；②中期：病变膝关节疼痛，触诊有摩擦感、滑膜有肥厚感，X线检查可见关节间隙狭窄。（4）符合中医辨证肝肾亏虚、筋脉瘀滞证[9]——①主证：关节疼痛，膝酸胫软；②次证：屈伸不利，动作牵强；舌质红，少苔，脉滑无力。（5）年龄45～75岁，男女不限；（6）近1个月内未应用其他药物或其他治疗方法；（7）对本研究知情同意并签署知情同意书。本研究的排除标准为：（1）哺乳期或妊娠期妇女；（2）存在继发性骨关节炎或影响关节的并发症者；（3）类风湿关节炎、结节病、急性创伤者；（4）合并心、脑、肝、肾等重要器官疾病及精神病者；（5）对本研究药物过敏者；（6）正在参与其他临床研究者。本研究的脱落标准为：（1）依从性差，影响本研究临床疗效者；（2）不按规定联合用药或自行采用与本研究无关的药物治疗者；（3）发生不良事件，不宜再参加本研究者；（4）自行退出、失访或死亡者。1.2研究对象将2021年9月－2022年8月被贵州省黔南布依族苗族自治州中医医院（以下简称“本院”）骨伤一科收治的单膝发病的早中期KOA患者100例作为研究对象（根据临床试验病例数应符合统计学要求和最低病例数要求原则，按照估算样本量公式计算[10]，得到本研究的样本数至少为100例）。其中男性61例，女性39例；年龄45～75岁，平均（53.87±11.16）岁；病程30～43个月，平均（35.89±3.59）个月；X线分级为Ⅰ级33例，Ⅱ级47例，Ⅲ级20例。将100例患者按照随机数字表法分成对照组和试验组，每组50例。两组患者的性别、年龄、病程及X线分级比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性，详见表1。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.09.14.T001表1两组患者一般资料比较（n＝50）组别性别/例年龄（x±s）/岁病程（x±s）/月X线分级/例男女Ⅰ级Ⅱ级Ⅲ级对照组302053.41±11.2336.03±3.4718239试验组311954.32±11.0835.74±3.731524111.3医学伦理要求本研究遵循《世界医学协会赫尔辛基宣言》和我国有关临床研究的法律、法规，研究方案通过本院医学伦理委员会审批[批件号：黔南中医院〔2021〕科（伦审）17号]。每例患者入组前，由研究人员以书面形式全面介绍本研究的目的、意义、程序、风险，所有入组患者自愿签署书面知情同意书。1.4治疗方法对照组患者口服双醋瑞因胶囊（商品名安必丁，阿根廷TRB Pharma S.A.，国药准字HJ20150131，规格50 mg），每次50 mg，每日2次。试验组患者在对照组治疗基础上给予鸡胚地龙贴膏（贵州水族药物开发有限责任公司，每袋含药芯2.5 g、湿润剂5 mL）外贴：先将湿润剂均匀涂于5 cm×9 cm的药芯袋表面，待药芯湿润后直接贴于膝关节疼痛处，随后固定，每日1次。两组疗程均为4周，疗程结束后3个月随访。1.5疗效判定标准治疗前、治疗4周后、疗程结束后3个月随访时分别采用KOA症状分级量表对两组患者的主要KOA症状（行走、坐位站立、蹲下、夜间疼痛或不适，晨僵，最大行走距离等）进行评分[9]，按照轻、中、重度分别记为1、2、3分，各症状评分总和即为症状积分，以此计算疗效指数。治疗4周后或疗程结束后3个月随访时的疗效指数＝（治疗前症状积分－治疗4周后或疗程结束后3个月随访时症状积分）/治疗前症状积分×100%。临床控制：疼痛等症状消失，关节活动正常，疗效指数≥95%，X线检查显示正常；显效：疼痛等症状消失，关节活动不受限，70%≤疗效指数＜95%，X线检查显示明显好转；有效：疼痛等症状基本消除，关节活动轻度受限，30%≤疗效指数＜70%，X线检查显示有好转；无效：疼痛等症状与关节活动无明显改善，疗效指数＜30%，X线检查显示无改变。总有效率（%）＝（临床控制例数+显效例数+有效例数）/总病例数×100%。1.6观察与检查指标1.6.1疼痛程度采用视觉模拟评分法（visual analogue scale，VAS）[11]对两组患者治疗前后及疗程结束后3个月随访时的疼痛程度进行评估，总分0～10分，分值越大表示疼痛越剧烈。1.6.2骨关节炎指数采用西安大略和麦克马斯特大学骨关节炎指数量表（Western Ontario and McMaster University osteoarthritis index，WOMAC）[12]对两组患者治疗前后及疗程结束后3个月随访时的骨关节炎病情进行评估，包括5项疼痛、2项僵硬、17项关节功能评分，总分为96分，分值越高表示病情越严重。1.6.3膝关节功能采用Lysholm膝关节功能评分表[13]对两组患者治疗前后及疗程结束后3个月随访时的膝关节功能进行评估，总分为100分，分值越低表示膝关节功能越差。1.6.4关节液指标采集两组患者治疗前后及疗程结束后3个月随访时的膝关节液各5 mL，对以下指标进行检测。（1）炎症因子指标：采用ELISA法测定肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-1β、IL-6水平；（2）氧化应激指标：采用化学法测定丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平，采用氮蓝四唑光化还原法测定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，采用硝酸还原酶法测定一氧化氮（nitric oxide，NO）水平；（3）骨代谢指标：采用ELISA法测定软骨寡聚基质蛋白（cartilage oligomeric matrix protein，COMP）、基质金属蛋白酶13（matrix metalloproteinase-13，MMP-13）、Ⅱ型胶原C端肽（C-telopeptide of type Ⅱ collagen，CTX-Ⅱ）水平。1.6.5不良反应记录两组患者不良反应的发生情况，并计算不良反应发生率。不良反应发生率（%）＝不良反应发生例数/总病例数×100%。1.7统计学方法采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析。计量资料以x±s表示，两组间比较若符合正态分布则采用独立样本t检验，若不符合正态分布则采用非参数秩和检验；治疗前后的比较采用配对t检验。计数资料以例数或率表示，两组间比较采用χ2检验和Fisher确切概率法。检验水准α＝0.05。2结果2.1两组患者临床疗效比较治疗4周后，试验组患者的总有效率为96.0%，对照组为90.0%，两组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；疗程结束后3个月随访时，试验组患者的总有效率为94.0%，显著高于对照组的62.0%（P＜0.05）。结果见表2。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.09.14.T002表2两组患者临床疗效比较（n＝50）组别治疗4周后疗程结束后3个月随访时临床控制/例显效/例有效/例无效/例总有效率/%临床控制/例显效/例有效/例无效/例总有效率/%对照组92412590.0215141962.0试验组17238296.0131915394.0aa：与同时期的对照组比较，P＜0.052.2两组患者疼痛程度评分比较治疗前，两组患者的VAS评分比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗4周后及疗程结束后3个月随访时，两组患者的VAS评分均显著低于治疗前，且同一时期试验组患者的VAS评分显著低于对照组（P＜0.05）。结果见表3。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.09.14.T003表3两组患者不同时期VAS、WOMAC、Lysholm评分比较（x±s，n＝50，分）组别时期VAS评分WOMAC评分Lysholm评分对照组治疗前6.98±1.7663.95±6.4773.62±4.85治疗4周后3.45±1.67a35.72±5.52a85.62±6.13a疗程结束后3个月随访时3.98±1.46a42.63±5.05a79.95±4.17a试验组治疗前6.96±1.7964.24±7.1273.25±4.62治疗4周后2.02±1.71ab32.97±4.38ab92.67±6.03ab疗程结束后3个月随访时2.25±1.24ac39.13±4.29ac90.81±5.43aca：与同组治疗前比较，P＜0.05；b：与对照组治疗4周后比较，P＜0.05；c：与对照组疗程结束后3个月随访时比较，P＜0.052.3两组患者骨关节炎指数评分比较治疗前，两组患者的WOMAC评分比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗4周后及疗程结束后3个月随访时，两组患者的WOMAC评分均显著低于治疗前，且同一时期试验组患者的WOMAC评分显著低于对照组（P＜0.05）。结果见表3。2.4两组患者膝关节功能评分比较治疗前，两组患者的Lysholm评分比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗4周后及疗程结束后3个月随访时，两组患者的Lysholm评分均显著高于治疗前，且同一时期试验组患者的Lysholm评分显著高于对照组（P＜0.05）。结果见表3。2.5关节液指标检测结果比较2.5.1炎症因子指标比较结果治疗前，两组患者关节液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。治疗4周后及疗程结束后3个月随访时，两组患者关节液中上述指标水平均显著低于治疗前，且同一时期试验组患者的上述指标水平显著低于对照组（P＜0.05）。结果见表4。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.09.14.T004表4两组患者不同时期关节液中炎症因子指标水平比较（x±s，n＝50，pg/mL）组别时期TNF-αIL-1βIL-6对照组治疗前37.65± 5.8449.32± 3.5665.43± 5.78治疗4周后22.13± 5.11a29.32± 2.67a39.72±5.63a疗程结束后3个月随访时29.41± 5.07a38.56±3.27a44.38±4.83a试验组治疗前37.23± 5.6449.41± 3.9264.39± 5.71治疗4周后13.45± 3.32ab22.43± 4.01ab28.64±3.38ab疗程结束后3个月随访时20.15± 3.47ac18.32± 2.63ac32.49±4.39aca：与同组治疗前比较，P＜0.05；b：与对照组治疗4周后比较，P＜0.05；c：与对照组疗程结束后3个月随访时比较，P＜0.052.5.2氧化应激指标比较结果治疗前，两组患者关节液中MDA水平、SOD活性、NO水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。治疗4周后及疗程结束后3个月随访时，两组患者关节液中MDA、NO水平均显著低于治疗前，SOD活性均显著高于治疗前，且同一时期试验组患者上述指标水平/活性均显著优于对照组（P＜0.05）。结果见表5。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.09.14.T005表5两组患者不同时期关节液中氧化应激指标水平/活性比较（x±s，n＝50）组别时期MDA/（nmol/mL）SOD/（U/mL）NO/（nmol/mL）对照组治疗前14.27±2.9867.91±8.2363.42±3.67治疗4周后7.95±2.28a89.23±8.57a42.52±3.36a疗程结束后3个月随访时9.62±2.93a80.14±7.95a50.57±3.54a试验组治疗前14.19±2.8368.19±8.7264.37±3.41治疗4周后4.62±1.65ab119.87±9.65ab23.54±2.71ab疗程结束后3个月随访时5.97±2.41ac103.25±9.13ac28.15±2.09aca：与同组治疗前比较，P＜0.05；b：与对照组治疗4周后比较，P＜0.05；c：与对照组疗程结束后3个月随访时比较，P＜0.052.5.3骨代谢指标比较结果治疗前，两组患者关节液中COMP、MMP-13、CTX-Ⅱ水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。治疗4周后及疗程结束后3个月随访时，两组患者关节液中上述指标水平均显著低于治疗前，且同一时期试验组患者上述指标水平均显著低于对照组（P＜0.05）。结果见表6。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.09.14.T006表6两组患者不同时期关节液中骨代谢指标水平比较（x±s，n＝50）组别时期COMP/（ng/mL）MMP-13/（ng/mL）CTX-Ⅱ/（μg/L）对照组治疗前371.56±56.023.09±0.67579.63±71.28治疗4周后298.41±46.57a2.43±0.43a432.57±66.58a疗程结束后3个月随访时324.19±49.71a2.67±0.41a503.56±68.27a试验组治疗前373.85±53.113.11±0.65580.36±73.57治疗4周后223.41±36.19ab1.91±0.42ab402.52±50.86ab疗程结束后3个月随访时246.13±40.25ac2.24±0.39ac436.71±49.54aca：与同组治疗前比较，P＜0.05；b：与对照组治疗4周后比较，P＜0.05；c：与对照组疗程结束后3个月随访时比较，P＜0.052.6两组患者不良反应发生情况比较两组患者不良反应发生率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表7。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.09.14.T007表7两组患者不良反应发生情况比较组别n轻度腹泻/例上腹痛/例尿黄/例皮肤瘙痒/例皮肤发红/例总发生率/%对照组50111006.0试验组50101118.03讨论KOA是一种以膝关节退行性病变为主的慢性疾病，由于其发病机制复杂多样，目前临床尚缺乏根治手段。中医将KOA归属于“痹证”“骨痹”范畴，认为其病机主要是肝肾不足亏虚、风寒湿邪气痹阻于关节，导致脉络瘀阻不畅，属“本虚标实、本痿标痹”之证；由于气血经络凝滞致瘀血阻滞不通，瘀血停留日久致脉络瘀阻，最终导致经络不荣不通引起膝关节肿胀疼痛、关节僵硬不适、肢体屈伸不利等，应以补益肝肾、活血通络等法治疗。鸡胚地龙贴膏方中续断具有补肝肾、强筋骨、续折伤之功，鸡胚能温中益气、补精填髓，二者共为君药，共奏强筋健骨、续骨接筋之功。地龙能清热通络，骨碎补能疗伤止痛、补肾强骨，透骨香能祛风除湿、散寒止痛、活血通络，水冬瓜根皮可活血袪瘀、舒筋接骨，四者共为臣药，助君药活血化瘀止痛。栀子能泻火除烦、清热利尿、凉血解毒，虎杖可利胆退黄、清热解毒、散瘀止痛、止咳化痰，制马钱子能通络止痛、散结消肿，三者共为佐药，助清热、化瘀、止痛之功。冰片清香为百药之先，作为使药，可增强君、臣、佐药通经、透皮、入骨之力。全方共奏活血化瘀止痛、补肾强筋续骨之效，符合KOA的病机。有研究表明，炎症反应、氧化应激反应和细胞外基质在KOA的发生、发展中起重要作用[14]。近年来研究发现，膝关节滑膜细胞与软骨细胞在自身受到刺激出现损伤或炎症时，可产生大量TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子，其中IL-1β和TNF-α可通过激活核因子κB、胞外信号调节激酶、c-Jun氨基端激酶和p38蛋白激酶等重要信号通路而引起炎症反应[15]；IL-1β能促进软骨细胞基质降解，造成软骨受损[16]；TNF-α、IL-6对软骨细胞、滑膜细胞分泌炎症递质具有刺激作用，并能降解关节软骨及胶原，造成边缘骨质受损，从而加重KOA病情[16]。MDA、NO和SOD均为重要的氧化应激反应生物标志物，其中NO具有抑制软骨细胞凋亡的作用，其表达水平与骨关节炎病情呈负相关[17]；正常情况下，MDA与SOD的表达呈动态平衡，当MDA水平明显升高、SOD水平明显下降时，会促进氧化应激反应发生，造成软骨基质损坏[16]。MMP-13、COMP、CTX-Ⅱ是常用的骨代谢生化标志物。研究表明，MMP-13可破坏软骨组织，参与关节软骨破坏过程[18]；COMP是早期诊断关节软骨基质退变的标志物，其表达水平与骨关节炎的病情进展显著相关[19]；CTX-Ⅱ是软骨的主要成分，其水平变化反映的是骨吸收程度，可作为骨关节炎的诊断标志物[20]。本研究结果显示，治疗4周后及疗程结束后3个月随访时，两组患者的TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA、NO、COMP、MMP-13、CTX-Ⅱ水平均较治疗前显著降低，SOD活性均较治疗前显著升高，且同一时期试验组患者的改善情况更明显，提示鸡胚地龙贴膏联合双醋瑞因治疗早中期KOA，可有效调节氧化应激反应，抑制关节液中炎症因子表达，提高骨代谢水平，从而改善KOA的临床症状，提高治疗有效率。目前临床上常采用VAS评分来评定KOA疼痛程度，用WOMAC评分来评定KOA症状和功能障碍情况，用Lysholm评分来评定KOA功能恢复状况[1，4]。本研究结果显示，治疗4周后及疗程结束后3个月随访时，两组患者的VAS评分、WOMAC评分均显著低于治疗前，Lysholm评分均显著高于治疗前，且同一时期试验组患者的改善情况更明显，提示鸡胚地龙贴膏联合双醋瑞因治疗早中期KOA，可有效减轻疼痛程度，改善KOA症状和功能障碍情况，促进关节功能恢复。本研究结果还显示，治疗4周后，试验组患者的总有效率（96.0%）与对照组（90.0%）差异不大，提示两组治疗方案均有较好疗效；但在疗程结束后3个月随访时，试验组患者的总有效率（94.0%）显著高于对照组（62.0%），提示联合用药方案的疗效相比单一使用双醋瑞因方案更持久稳定。本研究的不足之处为：（1）研究时间较短，就该方案的长期疗效及安全性而言，尚需进一步观察；（2）样本量较小，结果有待更大样本的研究进一步验证；（3）联合用药方案在改善炎症反应、氧化应激反应和骨代谢作用等方面的具体机制有待进一步研究。综上所述，鸡胚地龙贴膏联合双醋瑞因治疗早中期KOA，可通过抑制炎症反应、减少氧化应激反应、抑制软骨细胞及基质降解来减轻患者疼痛症状，改善患者膝关节功能，且不良反应发生率较低，临床应用价值较好。