变应性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是一种以鼻塞、流涕、打喷嚏、鼻痒为特征且病因复杂的鼻黏膜变应性炎症性疾病。近年来，AR的发病率显著升高，使10%～40%的全球人口深受困扰，已成为耳鼻喉科医师和患者共同关注的重要医疗问题[1―2]。细胞焦亡是近年来新发现的一种与炎症相关的细胞程序性死亡形式。有研究指出，活性氧（reactive oxygen species，ROS）/核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）/胱天蛋白酶1（caspase-1）/gasdermin D（GSDMD）作为经典的细胞焦亡通路，参与了AR的发生与发展[3―4]。当暴露于过敏原时，鼻黏膜会产生ROS，从而激活NLRP3炎症小体，使caspase-1活化，活化的caspase-1切割GSDMD，使鼻黏膜上皮细胞产生膜孔，同时使成熟的白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-18大量产生并分泌[5―6]，从而引发过度病理性炎症反应，导致鼻黏膜损伤；与此同时，鼻黏膜的损伤又会激活更多的复杂细胞信号转导并诱导炎症介质释放，形成“病理损伤-炎症反应-损伤加重”的恶性循环，最终加剧AR患者病情，甚至导致病情迁延不愈[7]。玉屏风散（Yupingfeng powder，YPF）是治疗肺卫气不固证的经典名方，在调节AR患者鼻黏膜组织形态和免疫因子、炎症细胞因子分泌等方面的效果确切[8]。玉屏风加味鼻喷剂（原名克敏芪丹鼻喷剂，Modified yupingfeng nasal spray，YPF+）是成都中医药大学附属医院耳鼻喉科田理教授在YPF的基础上加入牡丹皮、川芎研制而成的纯中药鼻喷剂，较原方具有更强的活血通窍功效，临床疗效显著[9―10]。本课题组前期研究表明，YPF+可减轻AR模型大鼠鼻黏膜损伤，并筛选出了最佳药效浓度（1.05 g/mL）、最佳给药剂量（每侧50 μg）及使用频次（每天2次）[11―12]，但其作用机制尚不清楚。因此，本研究以卵清蛋白（ovalbumin，OVA）诱导的AR模型大鼠为对象，进一步观察YPF+对其鼻黏膜损伤的改善作用，以及对细胞焦亡通路ROS/NLRP3/caspase-1/GSDMD的影响，初步探究该药治疗AR的潜在机制，以期为YPF+的临床应用提供理论依据。1材料1.1主要仪器本研究所用主要仪器包括DNM-9602G型酶标仪（成都普朗医疗设备有限公司）、Q2000A型聚合酶链反应（PCR）仪（杭州朗基科学仪器有限公司）、CX31型光学显微镜（日本Olympus公司）、JY300LIE型电泳仪（北京君意东方电泳设备有限公司）、Chemiscope 6100型显影仪（上海勤翔科学仪器有限公司）等。1.2主要药品与试剂YPF+[规格为每支装10 mL（每1 mL对应生药总量1.05 g）]由成都中医药大学附属医院药剂科根据现有工艺，以蜜炙黄芪、生白术、防风、酒川芎、牡丹皮5味中药为原料，煎煮并浓缩而得。阳性对照糠酸莫米松鼻喷雾剂[货号U025821，规格为每瓶60揿，每揿含糠酸莫米松（mometasone furoate，MF）50 μg，药物含量0.05%（g/g）]购自斯洛文尼亚Lek Pharmaceuticals d.d.公司；OVA、氢氧化铝粉末（货号分别为M0228A、MKCM1237）均购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；小鼠源NLRP3抗体（货号381207）、辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（货号511203）、HRP标记的山羊抗小鼠IgG二抗（货号511103）均购自成都正能生物技术有限责任公司；兔源caspase-1抗体（货号22915-1-AP）、兔源GSDMD抗体（货号20770-1-AP）、小鼠源磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）抗体（货号60004-1-Ig）均购自武汉三鹰生物技术有限公司；大鼠IL-1β酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（货号ER008-48）购自依科赛生物科技（太仓）有限公司；大鼠IL-18 ELISA试剂盒（货号GWNVYR39MV）购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；ROS检测试剂盒（货号S0033S）购自上海碧云天生物技术有限公司；无血清RPMI-1640培养液（货号C11875500BT）购自美国Gibco公司；苏木精染液（批号201901）购自上海懿洋仪器有限公司；伊红染液（批号2021012501）购自成都科隆化学品有限公司；RNA抽提试剂盒（货号R1200）、组化DAB显色剂试剂盒（货号DA1016）均购自北京索莱宝科技有限公司；ECL化学发光试剂盒（货号MA0186）、BCA蛋白定量试剂盒（货号MA0082）均购自成都美仑生物科技公司；cDNA第一链合成试剂盒（货号FP205）购自天根生化科技（北京）有限公司；其余试剂均为实验室常用规格，水为蒸馏水。1.3实验动物清洁级雄性SD大鼠40只，6～8周龄，体质量（170±10）g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供[动物生产许可证号SCXK（京）2019-0008]。所有实验程序和方案均经成都中医药大学附属医院实验动物伦理委员会批准（伦理审查编号2022DL-010）。所有大鼠均饲养于光线良好、温湿度适宜且通风的实验室内，自由摄食、饮水。2方法2.1造模、分组、给药与取材所有大鼠适应性喂养3 d后，参照文献方法[13]，采用OVA 0.3 mg+氢氧化铝30 mg（以生理盐水1 mL为溶剂）腹腔注射致敏，隔天1次，共7次。第14天，每只大鼠以2%OVA溶液（每侧50 μL）滴鼻，每天1次，共7天。在末次滴鼻结束30 min后，观察各组大鼠5 min内的行为并进行行为学评分——喷嚏：1～3个记1分，4～10个记2分，≥11个记3分；鼻痒：轻度瘙痒、抓挠1～2次记1分，剧烈瘙痒、抓挠＞2次记2分；鼻流涕：鼻涕流至鼻孔记1分，鼻涕超出鼻孔记2分，鼻涕流满面记3分；叠加各项评分得行为学评分，该评分超过5分即为造模成功[14]。造模成功后，按照随机数字表法将大鼠分为模型组、YPF+组、MF组，另设空白组，每组10只。YPF+组大鼠给予YPF+滴鼻，每侧50 μg（剂量参考前期研究结果设置[11―12]），每天2次；MF组大鼠给予MF鼻喷雾剂滴鼻，每侧50 μg（剂量参考其药品说明书设置），每天1次；空白组和模型组大鼠给予等量生理盐水滴鼻，每天2次，连续4周。末次给药并完成行为学评分后，采集各组大鼠腹主动脉血用于ELISA检测；取血后，处死大鼠，每组随机选取其中5只大鼠的鼻黏膜组织用于病理切片、流式细胞仪检测和免疫组化实验，剩余5只大鼠的鼻黏膜组织用于Western blot实验和反转录聚合酶链反应（reverse transcription PCR，RT-PCR）实验。2.2大鼠行为学评分末次给药结束30 min后，观察各组大鼠5 min内的行为，并按“2.1”项下标准进行行为学评分[14]。2.3大鼠鼻黏膜病理切片观察取“2.1”项下各组5只大鼠的鼻中隔及鼻腔外侧壁黏膜组织适量，置于4%多聚甲醛溶液中固定48 h，脱水，石蜡包埋后切片（厚度3 μm），经苏木精-伊红（HE）染色（苏木精染液按照Harris方法配制[15]；伊红染液以水为溶剂，浓度为0.25%），并使用显微镜观察其鼻黏膜组织的病理改变；同时，任选10个200倍视野，观察各组大鼠鼻黏膜上皮层、基底膜、固有层和黏膜下层的状况并进行量化评分——（1）炎症细胞浸润程度：未见炎症细胞记0分，可见少数散落炎症细胞记1分，可见较多炎症细胞记2分，炎症细胞占全部上皮面积的2/3以上记3分；（2）上皮的化生程度：未见上皮化生记0分，上皮化生占全部上皮面积的1/3以下记1分，上皮化生占全部上皮面积的1/3～2/3记2分，上皮化生占全部上皮面积的2/3以上记3分；（3）黏膜固有层腺体增生：未见腺体记0分，腺体占黏膜固有层面积的1/3以下记1分，腺体占黏膜固有层面积的1/3～2/3记2分，腺体占黏膜固有层面积的2/3以上记3分；（4）血管扩张充血：血管未见异常记0分，血管轻度扩张、充血记1分，血管明显扩张、充血记2分，血管明显扩张、充血并有增生记3分；叠加各项评分即为病理评分[16]。2.4大鼠鼻黏膜组织中ROS水平的检测采用流式细胞仪进行检测。取“2.3”项下各组5只大鼠的鼻黏膜组织适量，切成面积约1 mm2的小片，用磷酸盐缓冲液清洗后，加入胶原酶1 mL，于37 ℃下孵育10 min（每5 min振摇1次）；待组织解离完全后，用3%胎牛血清终止消化，并以70 μm滤网滤过；细胞加入磷酸盐缓冲液10 mL，离心，吸去上清液；细胞加入2′，7′-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）工作液（用无血清RPMI-1640培养液制备，终浓度为10 μmol/L）500 μL，于37 ℃下孵育20 min，以无血清RPMI-1640培养液清洗3次，再以磷酸盐缓冲液重悬，使用流式细胞仪检测其荧光强度，用以表示ROS水平（两者成正比）。2.5大鼠鼻黏膜组织中NLRP3、caspase-1、GSDMD蛋白表达的检测2.5.1免疫组化实验取“2.3”项下各组大鼠的鼻黏膜组织石蜡切片，脱蜡至水，进行抗原修复以阻断内源性过氧化氢酶，滴加3%山羊血清封闭30 min，滴加NLRP3、caspase-1、GSDMD一抗（稀释比例均为1∶50），于4 ℃下孵育过夜；滴加相应二抗（稀释比例为1∶200），于37 ℃下孵育30 min；用磷酸盐缓冲液洗涤5 min×3次，加入DAB显色；用水冲洗，以苏木精染液轻度复染，脱水，以中性树胶封片，置于显微镜下观察。以棕黄色为阳性染色，采用Image-Pro Plus软件检测阳性区域的平均光密度（average optical，AO）值，用以表示NLRP3、caspase-1、GSDMD蛋白的表达水平（两者成正比）。2.5.2Western blot实验取“2.3”项下各组剩余5只大鼠的鼻黏膜组织，提取总蛋白后使用BCA法测定蛋白浓度；蛋白变性后，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并转移至聚偏二氟乙烯膜上，用5%脱脂奶粉封闭1 h；加入NLRP3、GSDMD、caspase-1、GAPDH一抗（稀释比例分别为1∶1 500、1∶1 000、1∶500、1∶1 000），于4 ℃下孵育过夜；用磷酸盐缓冲液清洗10 min×3次，加入相应二抗（稀释比例为1∶10 000），避光孵育45 min；用磷酸盐缓冲液清洗10 min×3次，以ECL发光试剂显色，于显影仪下成像并使用Image J软件分析各条带灰度值，以GAPDH作为内参，计算各目标蛋白的表达水平。2.6大鼠鼻黏膜组织中NLRP3、caspase-1、GSDMD mRNA表达的检测采用RT-PCR进行检测。取“2.3”项下各组剩余5只大鼠的鼻黏膜组织100 mg，研磨匀浆，按照RNA抽提试剂盒说明书方法提取RNA，按照cDNA第一链合成试剂盒说明书方法反转录得cDNA。以上述cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系（共20 μL）包括cDNA模板1 μL，上、下游引物各1 μL，SYBR Green 10 μL，DEPC水7 μL。反应条件如下：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性10 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，进行40个循环。以β-actin为内参，采用2－ΔΔCt法计算各目标基因mRNA的表达水平并以空白组为标准进行归一化处理。各目标基因引物由成都瑞普信生物技术有限公司设计，由赛默飞世尔科技（中国）有限公司合成，具体序列及产物长度见表1。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.10.10.T001表1目标基因引物序列及产物长度目标基因引物序列产物长度/bpNLRP3上游：5′-TCTGTTCATTGGCTGCGGAT-3′314下游：5′-GCCTTTTTCGAACTTGCCGT-3′caspase-1上游：5′-CACGAGACCTGTGCGATCAT-3′239下游：5′-CTTGAGGGAACCACTCGGTC-3′GSDMD上游：5′-CAGTGGACTGCCTTCGGAAT-3′197下游：5′-AGTCACACGCAGCATACACA-3′β-actin上游：5′-CGTTGATATCCGTAAAGACC-3′286下游：5′-TACATAACAGTCCGCCTAGAAG-3′2.7大鼠血清中IL-1β、IL-18含量的检测取“2.1”项下各组大鼠的腹主动脉血适量，于4 ℃下静置过夜，离心，取上层血清，使用ELISA法以酶标仪于450 nm波长下检测各组大鼠血清中IL-1β、IL-18含量，严格按照试剂盒说明书操作。2.8统计学方法使用SPSS 25.0软件对数据进行统计分析。计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。3结果3.1YPF+对大鼠行为学评分的影响与空白组比较，模型组大鼠的行为学评分显著升高（P＜0.05）。与模型组比较，YPF+组和MF组大鼠的行为学评分均显著降低（P＜0.05）。结果见图1A。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.10.10.F001图1各组大鼠的行为学评分和病理评分a：与空白组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.053.2YPF+对大鼠鼻黏膜组织病理损伤的影响空白组大鼠鼻黏膜组织形态正常。模型组大鼠鼻黏膜组织结构紊乱，纤毛大片倒伏、脱落，炎症细胞浸润严重，固有层血管扩张，病理评分较空白组显著升高（P＜0.05）。YPF+组大鼠鼻黏膜组织上皮排列整齐，纤毛完整、方向一致，炎症细胞浸润减轻，固有层血管无明显扩张；MF组大鼠鼻黏膜组织炎症细胞浸润改善，但上皮层恢复情况一般；两组大鼠的病理评分均较模型组显著降低（P＜0.05）。结果见图1B、图2。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.10.10.F002图2各组大鼠鼻黏膜组织的病理变化（HE染色， ×200）黑色箭头：纤毛及上皮细胞；绿色箭头：腺体；黄色箭头：血管；蓝色箭头：炎症细胞浸润3.3YPF+对大鼠鼻黏膜组织中ROS水平的影响与空白组比较，模型组大鼠鼻黏膜组织中ROS水平显著升高（P＜0.05）。与模型组比较，YPF+组和MF组大鼠鼻黏膜组织中ROS水平均显著下降（P＜0.05）。结果见图3。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.10.10.F003图3各组大鼠鼻黏膜组织中的ROS水平a：与空白组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.053.4YPF+对大鼠鼻黏膜组织中NLRP3、caspase-1、GSDMD蛋白表达的影响3.4.1免疫组化实验与空白组比较，模型组大鼠鼻黏膜组织中NLRP3、caspase-1、GSDMD蛋白的表达水平均显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，YPF+组和MF组大鼠鼻黏膜组织中上述蛋白的表达水平均显著下降（P＜0.05）。结果见图4。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.10.10.F004图4各组大鼠鼻黏膜组织中NLRP3、caspase-1、GSDMD蛋白的表达（免疫组化法）a：与空白组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.053.4.2Western blot实验与空白组比较，模型组大鼠鼻黏膜组织中NLRP3、caspase-1、GSDMD蛋白的表达均显著上调（P＜0.05）。与模型组比较，YPF+组和MF组大鼠鼻黏膜组织中上述蛋白的表达均显著下调（P＜0.05）。结果见图5。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.10.10.F005图5各组大鼠鼻黏膜组织中NLRP3、caspase-1、GSDMD蛋白的表达（Western blot法）a：与空白组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.053.5YPF+对大鼠鼻黏膜组织中NLRP3、caspase-1、GSDMD mRNA表达的影响与空白组比较，模型组大鼠鼻黏膜组织中NLRP3、caspase-1、GSDMD mRNA的表达均显著上调（P＜0.05）。与模型组比较，YPF+组和MF组大鼠鼻黏膜组织中NLRP3、caspase-1、GSDMD mRNA的表达均显著下调（P＜0.05）。结果见图6。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.10.10.F006图6各组大鼠鼻黏膜组织中NLRP3、caspase-1、GSDMD mRNA的表达（x±s，n＝5）a：与空白组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.053.6YPF+对大鼠血清中IL-1β、IL-18含量的影响与空白组比较，模型组大鼠血清中IL-1β、IL-18含量均显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，YPF+组和MF组大鼠血清中IL-1β、IL-18含量均显著下降（P＜0.05）。结果见图7。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.10.10.F007图7各组大鼠血清中IL-1β、IL-18含量（x±s，n＝10）a：与空白组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.054讨论AR的发病率、复发率高，但防治手段有限，加之该症与过敏性结膜炎、分泌性中耳炎、鼻窦炎、鼻息肉、哮喘等疾病的发生密切相关，严重影响患者的生活质量，增加社会的经济负担[1]。目前，鼻用糖皮质激素和抗组胺药是AR临床治疗的常用手段，主要用于减轻患者症状，但长期使用可能会导致鼻出血、嗜睡等不良反应的发生[17―18]。随着中医药防治AR理论探索和临床研究的不断进展，中医药在AR防治中的优势逐渐显露，可弥补鼻用糖皮质激素和抗组胺药等现有药物的不足[18]。AR属中医学“鼻鼽”范畴。中医学认为，鼻鼽主要病因病机与正气不足、脏腑虚损有关，尤以肺脏为主，因肺气虚，卫表不固，风、寒、戾气等外邪乘虚侵入而鼻窍不利。田理教授在长期临证中总结出“肺卫不固、血瘀鼻窍”的AR核心病机，并在《理瀹骈文》“外治之理，即内治之理”的启发下，提出了“益气固表、活血通窍”的中医外治法，即在YPF的基础上，加牡丹皮和川芎，制成YPF+，该制剂已在临床应用20余年，疗效确切。AR作为发生在鼻黏膜上的慢性炎症性疾病，越来越多的证据表明由caspase-1介导的经典细胞焦亡通路NLRP3/caspase-1/GSDMD参与了AR的发生与发展[3―4，19―20]。一项关于AR的研究发现，大鼠鼻黏膜组织中NLRP3、caspase-1、GSDMD的表达，血清中IL-1β、IL-18含量与AR模型大鼠的行为学评分呈正相关，NLRP3炎症小体及其下游因子IL-1β、IL-18分泌越多，AR的炎症程度就越高，提示NLRP3炎症小体参与了AR鼻黏膜的炎症性损伤，IL-1β、IL-18是AR炎症反应不可缺少的一部分[20]。本研究结果显示，模型组大鼠鼻黏膜组织结构紊乱，固有层血管扩张，并可见明显的炎症细胞浸润，其行为学评分＞5分，AR模型复制成功；经YPF+干预后，大鼠鼻黏膜组织上皮排列整齐，固有层血管无明显扩张且炎症细胞浸润减少，行为学评分和病理评分均较模型组显著下降。本研究结果还显示，与空白组比较，模型组大鼠鼻黏膜组织中NLRP3、caspase-1、GSDMD蛋白及mRNA的表达水平，以及血清IL-1β、IL-18含量均显著升高，说明OVA诱导的AR模型大鼠的鼻黏膜组织发生了细胞焦亡和炎症反应，与Yu等[21]的研究结果基本一致。与模型组比较，YPF+组大鼠鼻黏膜组织中NLRP3、caspase-1、GSDMD蛋白及mRNA的表达水平，以及血清中IL-1β、IL-18含量均显著降低，提示YPF+可下调NLRP3/caspase-1/GSDMD通路各蛋白的表达，降低血清中IL-1β、IL-18含量，从而影响细胞焦亡过程。有研究表明，ROS是AR相关NLRP3炎症小体激活的原因[22―23]。因此，为了明确YPF+调控NLRP3炎症小体的上游机制，本研究检测了大鼠鼻黏膜组织中ROS水平。结果显示，模型组大鼠鼻黏膜组织中ROS水平显著高于空白组，提示大鼠鼻黏膜组织损伤和炎症反应的加剧可能与ROS水平的升高有关；经药物干预后，YPF+组大鼠鼻黏膜组织中ROS水平显著降低，提示YPF+对大鼠鼻黏膜组织损伤和炎症反应的改善作用可能与其降低ROS水平有关。综上所述，YPF+可改善大鼠鼻黏膜损伤，减轻其喷嚏、鼻痒、鼻涕等AR症状，这种作用可能与其减少鼻黏膜ROS产生、下调细胞焦亡通路NLRP3/caspase-1/GSDMD有关。