奥卡西平的化学名为10，11-二氢-10-氧代-5H-二苯并[b，f]氮杂-5-甲酰胺，是卡马西平的10-酮基衍生物，主要用于成人及儿童癫痫简单及复杂部分性发作、全身强直阵挛发作等的单药或联合治疗。作为一种新型的抗癫痫药物，奥卡西平具有不良反应少、酶诱导作用弱等特点[1―2]。临床实践表明，该药对癫痫患者认知功能障碍具有一定的改善作用[3]。奥卡西平片现行质量标准有关物质的测定均采用高效液相色谱（HPLC）法[4―6]。本课题组前期在对2020年版《中国药典》（二部）奥卡西平片“有关物质”项下方法进行验证时发现，杂质K和杂质L的色谱峰重叠，杂质I的色谱峰拖尾严重；同时，该法流动相的pH为3.0，该酸性条件易使奥卡西平生成酰胺-亚胺醇式互变异构体[7]，从而导致干扰峰的出现，分离效果有限。奥卡西平片现行进口注册标准所用HPLC法的分析时长为65 min，流动相组成较为复杂，杂质C和杂质E色谱峰的分离度小于1.5，分离效果欠佳。为进一步优化奥卡西平制剂有关物质的检测方法，加强其质量控制，本研究参考《美国药典》（USP 43）、《欧洲药典》（EP 10.0）和进口注册标准对已知杂质（杂质A、B、C、D、E、I、K、L、N）的要求[5―6]，采用分析速度快、灵敏度和分离效率高的超高效液相色谱（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC）法对上述杂质进行定量分析，现报道如下。1材料1.1主要仪器本研究所用主要仪器包括Waters Acquity型UPLC仪（美国Waters公司）、MSA36S-OCE-DH型百万分之一电子天平（德国Satorious公司）、KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，频率40 kHz，功率500 W）等。1.2主要药品与试剂奥卡西平对照品（批号100657-201102，纯度99.8%）、杂质A（批号100142-201706，纯度100.0%）均购自中国食品药品检定研究院；杂质B（批号0202-RC-0020，纯度99.8%）购自广州佳途科技股份有限公司；杂质C（批号25-MAY-20-05，纯度99.5%）、杂质D（批号17-MAY-20-06，纯度99.87%）、杂质I（批号19-MAY-20-02，纯度96.3%）、杂质K（批号13-NOV-21-03，纯度96.27%）、杂质L（批号19-SEP-21-04，纯度97.66%）、杂质N（批号11-JUN-18-01，纯度99.9%）均购自美国QCC公司；杂质E（批号0872011，纯度99.9%）购自北京坛墨质检科技股份有限公司；奥卡西平片原研制剂（批号分别为TT434、TV270、T2391，规格均为300 mg）由瑞士Novartis公司生产；奥卡西平片仿制制剂分别由国内Ⅰ企业（批号分别为18108、19030、19410，规格均为300 mg）和国内Ⅱ企业（批号分别为18054、18043、19003，规格均为300 mg）生产；空白辅料由国内Ⅰ企业提供；抗坏血酸（批号XC27K030，纯度≥99.0%，分析纯）购自德国CNW公司；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。2方法与结果2.1色谱条件以ZORBAX Eclipse Plus C18（3 mm×150 mm，1.8 μm）为色谱柱，乙腈为流动相A、0.01 mol/L乙酸铵溶液（用冰醋酸调节pH至6.0）为流动相B进行梯度洗脱（洗脱程序见表1）；流速为0.5 mL/min；检测波长为230 nm；柱温为35 ℃；进样量为10 μL。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.10.09.T001表1梯度洗脱程序时间/minA/%B/%0257521257530406030.125754025752.2溶液的制备2.2.1溶剂称取适量抗坏血酸，加水溶解，制成浓度为0.01 mol/L的抗坏血酸溶液，再与乙腈按体积比1∶1混合，作为溶剂。2.2.2混合对照品溶液精密称取奥卡西平对照品适量，置于100 mL容量瓶中，加“2.2.1”项下溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，得奥卡西平质量浓度约为0.1 mg/mL的对照品溶液；精密称取杂质A、B、C、D、E、I、K、L、N对照品各适量，分别置于25 mL容量瓶中，加乙腈适量并超声使溶解，用“2.2.1”项下溶剂稀释至刻度，摇匀，得杂质A质量浓度约为500 μg/mL，杂质D、I质量浓度均约为200 μg/mL，杂质B、C、E、K、L、N质量浓度均约为100 μg/mL的单个杂质对照品储备液；精密量取上述奥卡西平对照品溶液及单个杂质对照品储备液各1 mL，置于同一100 mL容量瓶中，用“2.2.1”项下溶剂稀释至刻度，摇匀，得混合对照品溶液。2.2.3系统适用性待测溶液精密量取“2.2.2”项下奥卡西平对照品溶液及单个杂质对照品储备液各0.5 mL，置于同一100 mL容量瓶中，用“2.2.1”项下溶剂稀释至刻度，摇匀，得系统适用性待测溶液。2.2.4供试品溶液将本品粉碎，取细粉适量（约相当于奥卡西平100 mg），精密称定，置于100 mL容量瓶中，加“2.2.1”项下溶剂适量，在23 ℃下超声15 min，振摇使溶解；再用“2.2.1”项下溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，得供试品溶液。2.2.5空白辅料溶液按处方比例称取空白辅料37.5 mg，置于25 mL容量瓶中，用“2.2.1”项下溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，得空白辅料溶液。2.3系统适用性试验取“2.2”项下系统适用性待测溶液、供试品溶液（批号18108）和空白辅料溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果显示，各色谱峰的分离度均大于1.5，奥卡西平及各杂质色谱峰的理论板数均超过5 000，空白辅料和溶剂对主峰无干扰。结果见图1A～图1C。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.10.09.F001图1系统适用性试验和破坏试验的UPLC图1：杂质I；2：未知杂质；3：奥卡西平；4：杂质N；5：杂质K；6：杂质A；7：杂质D；8：杂质L；9：杂质B；10：杂质E；11：杂质C2.4破坏试验精密称取奥卡西平片样品（批号18108）适量（约相当于奥卡西平50 mg）共5份，置于50 mL容量瓶中，加入乙腈10 mL，超声溶解，然后分别进行酸破坏（加1 mol/L盐酸溶液2 mL，室温避光放置2 h后，加入1 mol/L氢氧化钠溶液2 mL）、碱破坏（加1 mol/L氢氧化钠溶液2 mL，室温避光放置2 h后，加入1 mol/L盐酸溶液2 mL）、氧化破坏（加30%过氧化氢溶液5 mL，室温避光放置5 h）、光照破坏（2 000 lx照射24 h）、高温破坏（90 ℃水浴24 h）试验。待试验结束后，取上述各溶液，用“2.2.1”项下溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，并以未进行上述试验的供试品溶液（批号18108）作为未破坏溶液进行对比。结果显示，在不同破坏条件下检出的杂质种类（图1D～图1H）与未破坏溶液（图1B）基本一致，奥卡西平色谱峰与各杂质色谱峰均能有效分离；其中，奥卡西平对氧、光照均具有较好的稳定性，酸破坏条件下杂质I的含量有所增加，高温条件下杂质D的含量增加较为明显，碱破坏条件下未知杂质和杂质B、D的含量均有明显增加。2.5线性关系和校正因子考察依次移取“2.2.2”项下奥卡西平对照品溶液及单个杂质对照品储备液0.2、0.5、0.8、1、1.2、1.5 mL，置于100 mL容量瓶中，用“2.2.1”项下溶剂稀释至刻度，摇匀，制成系列线性溶液，再按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积。以奥卡西平和各杂质质量浓度（x）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，并按下式计算校正因子：校正因子＝奥卡西平线性方程的斜率/杂质线性方程的斜率。结果见表2。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.10.09.T002表2奥卡西平及有关物质的线性关系、校正因子、检测限和定量限待测成分回归方程r线性范围/（μg/mL）校正因子检测限/（μg/mL）定量限/（μg/mL）奥卡西平y＝21 951x－159.580.999 90.192～1.4401.000.0460.152杂质Ay＝21 885x－1 794.900.999 81.019～7.6391.000.0370.122杂质By＝18 752x－1 481.620.999 70.208～1.5591.170.0490.162杂质Cy＝62 446x－1 575.530.999 90.230～1.7270.350.0270.090杂质Dy＝60 272x－3 612.110.999 70.389～2.9150.360.0770.258杂质Ey＝354 048x－4 224.700.999 70.182～1.3640.060.0400.132杂质Iy＝15 646x+39.820.999 50.393～2.9451.400.1140.380杂质Ky＝23 556x－822.440.999 80.199～1.493/0.0540.181杂质Ly＝15 068x－838.020.999 60.199～1.490/0.0550.185杂质Ny＝216 751x－5 643.390.999 90.200～1.5030.100.0390.130/：非特定杂质，无需计算校正因子2.6检测限与定量限取“2.2.2”项下混合对照品溶液，用“2.2.1”项下溶剂逐级稀释，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，以信噪比3∶1计算检测限，信噪比10∶1计算定量限。结果见表2。2.7精密度试验取奥卡西平片样品（批号18108），按“2.2.4”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果显示，供试品溶液中仅检出杂质B、D、I和未知杂质，奥卡西平和上述杂质峰面积的RSD为0.2%～2.7%（n＝6），表明方法精密度良好。2.8重复性试验取同一批奥卡西平样品（批号18108），按“2.2.4”项下方法平行制备供试品溶液6份，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果显示，供试品溶液中仅检出杂质B、D、I和未知杂质；按加校正因子的主成分自身对照法计算杂质B、D、I的含量，按不加校正因子的主成分自身对照法计算未知杂质的含量，得上述杂质含量及总含量的RSD分别为1.5%、3.4%、2.0%、4.0%、1.1%（n＝6）。2.9稳定性试验取“2.2.4”项下供试品溶液（批号18108），于室温下避光放置0、2、4、6、8、12、18、24 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果显示，供试品溶液中仅检出杂质B、D、I和未知杂质，其峰面积的RSD均小于3.0%（n＝8），同时未见新杂质出现，提示供试品溶液避光放置24 h内较稳定。2.10回收率试验依次移取“2.2.2”项下奥卡西平对照品溶液及单个杂质对照品储备液0.8、1、1.2 mL，置于100 mL容量瓶中，用“2.2.1”项下溶剂稀释至刻度，分别制成杂质A质量浓度约为4、5、6 μg/mL，杂质D、I质量浓度均约为1.6、2、2.4 μg/mL，奥卡西平和其他杂质质量浓度均约为0.8、1、1.2 μg/mL的低、中、高质量浓度回收率对照品溶液。称取空白辅料适量，置于25 mL容量瓶中，共9份，分别加入上述不同质量浓度的回收率对照品溶液溶解并定容，每质量浓度平行制备3份，作为回收率待测溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算回收率（未知杂质回收率以奥卡西平计算）。结果显示，各杂质的平均回收率为92.8%～105.6%，RSD均不大于3.0%（n＝9），表明方法准确度良好。2.11耐用性试验取奥卡西平片样品（批号18108），按“2.2.4”项下方法制备供试品溶液，分别考察不同柱温（±3 ℃）、流动相pH（±0.2）和流速（±10%）对供试品溶液有关物质测定的影响，每个条件重复3次。结果显示，供试品溶液中仅检出杂质B、D、I和未知杂质，分离度良好；不同色谱条件下，上述杂质含量及总含量的RSD分别为3.6%、4.4%、4.3%、3.7%、2.2%（n＝3），表明方法耐用性良好。2.12样品有关物质的测定取3个企业的奥卡西平片样品，按“2.2.4”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。3个企业样品中均检出同一未知杂质（Ⅰ企业某批样品除外），原研制剂中检出杂质K，仿制制剂中普遍检出杂质A、B、D、I。采用加校正因子的主成分自身对照法计算杂质A、B、D、I的含量，采用不加校正因子的主成分自身对照法计算杂质K和未知杂质的含量，结果见表3。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.10.09.T003表3样品中有关物质的测定结果（%）来源批号杂质A杂质B杂质C杂质D杂质E杂质I杂质K杂质L杂质N未知杂质总杂质瑞士Novartis 公司TT434－－－－－－0.065－－0.0170.082TV270－－－－－－0.064－－0.0140.078T2391－－－－－－0.067－－0.0160.083国内Ⅰ企业18108－0.029－0.027－0.076－－－0.0150.147190300.0230.034－0.027－0.063－－－0.0160.163194010.0140.046－0.032－0.060－－－－0.152国内Ⅱ企业190030.0120.029－－－0.017－－－0.0270.085180540.0140.036－－－0.018－－－0.0290.097180430.0130.087－－－0.022－－－0.0390.161－：未检出3讨论3.1杂质来源分析根据破坏试验结果和相关生产工艺，奥卡西平的杂质B、D、I可能为降解杂质，杂质A、C、E、K、L、N可能为原料药中的工艺杂质。本课题组采用ADMET Predictor 8.0软件对各杂质进行毒性预测，结果显示，奥卡西平中的杂质D、N具有一定肝毒性和致突变性，杂质I、C具有一定致突变性。同时，有研究表明，杂质D、I等作为奥卡西平的酮基化产物，其急性毒性和长期毒性均强于其他转化产物[8―10]。因此，有必要对这些杂质的含量进行检测和控制，以确保临床用药的安全性。3.2溶剂的选择为保证奥卡西平和各杂质对照品在溶剂中的稳定性，本课题组前期参考《美国药典》（USP 43）的相关方法，以0.01 mol/L抗坏血酸溶液-乙腈（1∶1，V/V）作为溶剂。结果显示，各成分在此溶剂中24 h内的稳定性优于以乙腈-0.01 mol/L乙酸铵溶液（pH6.0）（40∶60，V/V）为溶剂，且定量分析不受溶剂干扰，因此本研究选用0.01 mol/L抗坏血酸溶液-乙腈（1∶1，V/V）作为溶剂。3.3破坏试验结果在破坏试验中，奥卡西平在氧化、光照破坏条件下性质较稳定，均未发生明显降解。在碱性条件下，其色谱图变化较为明显，保留时间5.0 min处的未知杂质含量增加，但该降解杂质的具体结构有待进一步确认，以完善奥卡西平的质量标准。3.4有关物质测定结果2020年版《中国药典》（二部）奥卡西平片有关物质的限度要求如下：供试品溶液色谱图中如有杂质峰，单个杂质峰面积不得大于对照品溶液主峰面积（0.5%），各杂质峰面积总和不得大于对照品溶液主峰面积的2倍（1.0%）[4]；《美国药典》（USP 43）规定，若从供试品溶液中检出杂质，杂质A的含量不得过0.5%，杂质D、I的含量均不得过0.2%，其他单个杂质的含量不得过0.1%，杂质总量不得过1.0%[5]；《欧洲药典》（EP 10.0）要求，杂质B、I的含量均不得过0.1%，杂质K、L的含量总和不得过0.1%，其他单个杂质的含量不得过0.05%，杂质总量不得过0.5%[6]。本研究样品测定结果显示，3个企业样品均符合各质量标准对有关物质的限度要求。其中，仿制制剂样品中检出杂质4～5个，原研制剂样品中检出杂质2个；各企业产奥卡西平片中的杂质有所不同，且原研制剂样品相较于仿制制剂样品的杂质种类更少（仿制制剂样品中的杂质主要为杂质A、B、D、I和未知杂质，原研制剂样品仅检出杂质K和未知杂质）。原研制剂样品和仿制制剂样品中含量最高的杂质分别为杂质K、I、B；国内Ⅰ企业产样品的总杂质含量最高，国内Ⅱ企业产样品中的未知杂质含量明显高于国内Ⅰ企业产样品和原研制剂样品。由于国内外产品所用原辅料不同，所含杂质存在一定的差异，但原研制剂的杂质检出数量和含量在总体上均低于仿制制剂。因此，国内企业应重视产品生产过程中上述杂质的控制，可通过改进工艺来提升制剂质量。综上所述，本研究建立的UPLC法快速，灵敏度高，准确度、稳定性、耐用性好，可用于同时测定奥卡西平片中9种已知杂质的含量，可为该制剂有关物质的检测提供新方法。