北沙参是伞形科植物珊瑚菜Glehnia littoralis Fr. Schmidt ex Miq.的干燥根，主要分布于中国（东部沿海地区）、日本、朝鲜、俄罗斯和美国[1]，具有养阴清肺、益胃生津的功效[2]。作为常用传统药材，北沙参早在明朝就被种植[3]，但其野生药材被长期无序采挖，资源遭到严重破坏，在《中国生物多样性红色名录-高等植物卷》中被列为极度濒危物种[4]，导致产量不能满足市场需求。为加强北沙参资源保护，开展其药用部位（根）与非药用部位（茎叶）的利用研究十分必要。研究显示，北沙参的根具有抗氧化[5]、抗癌[1]、抗炎[6]、抗脂肪形成[7]、免疫调节[8]和抗菌[9]等活性；而关于北沙参的茎叶，相关研究主要集中于多糖[10]、黄酮类[11]、香豆素[12]和微量元素[13]等成分的研究。北沙参挥发油的研究主要集中于根[14]，而对于茎叶的研究几乎无报道。本研究对北沙参茎叶和根中挥发油进行提取工艺优化，比较它们所含化学成分的异同，并对二者抗黄曲霉与茄病镰刀菌等真菌的活性进行研究，以期为北沙参地上部位挥发油的利用提供理论依据。1材料1.1植物来源2020年10月21日本课题组在河北省安国市采集北沙参的茎叶和根，经河北中医学院药学院赵云生教授鉴定为伞形科植物珊瑚菜G. littoralis Fr. Schmidt ex Miq.的茎叶和根，植物标本保存于河北中医学院标本馆。1.2主要仪器7890B/5977B型气相色谱-质谱联用（GC-MS）仪购自美国Agilent公司；FW100型粉碎机购自天津泰斯特仪器有限公司；BSA224S-CW型万分之一电子分析天平购自赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；GHP-9050型恒温培养箱购自上海一恒科学仪器有限公司。1.3主要菌种与试剂寄生曲霉（编号BNCC144221）购自北京北纳创联生物技术研究所；茄病镰刀菌、半裸镰刀菌和尖孢镰刀菌由河北中医学院药学院房慧勇副教授捐赠；黄曲霉由河北中医学院河北省中药炮制技术创新中心实验室分离。正己烷为色谱纯，其他试剂均为分析纯。2方法2.1挥发油的提取2.1.1单因素实验根据2020年版《中国药典》（四部）通则“挥发油测定法（甲法）”提取方法[2]对北沙参茎叶和根中挥发油的提取进行优化，分别设对照组、处理1组、处理2组、处理3组，具体提取过程如下。（1）对照组（水蒸气蒸馏提取）：取供试品100 g，称定质量（精确至0.01 g），置于2 L圆底烧瓶中，加1 L水与玻璃珠数粒，振摇混合后，连接挥发油测定器与回流冷凝管；自冷凝管上端加水使其充满挥发油测定器的刻度部分，并溢流入烧瓶时为止；置电热套中缓缓加热至沸腾，并保持微沸约5 h，至测定器中油量不再增加，停止加热；放置片刻后，开启测定器下端的活塞，将水缓缓放出，至油层上端到达刻度0线上面5 mm处为止；放置1 h以上，再开启活塞使油层下降至其上端恰与刻度0线平齐，读取挥发油量，计算供试品中挥发油含量（％），并于分析前储存在4 ℃的琥珀色小瓶中。每个实验平行3次。（2）处理1组（蒸馏瓶辅助提取）：在对照组圆底烧瓶和挥发油测定器之间放置一个蒸馏瓶，并将北沙参粉末放在蒸馏瓶中，不与水接触，其他操作同对照组。（3）处理2组（NaCl溶液提取）：用20%的NaCl溶液代替对照组的蒸馏水，其他操作同对照组。（4）处理3组（KCl溶液提取）：分别用10%、15%和20%的KCl溶液代替对照组中的蒸馏水[15]，其他操作同对照组。计算北沙参茎叶挥发油和根挥发油的提取率，提取率（g/kg）＝（挥发油的质量/植物的质量）×1 000。2.1.2正交实验在“2.1.1”项单因素实验基础上，采用L9（34）正交表设计优化提取条件，其中料液比、蒸馏时间和KCl浓度被认为是影响挥发油提取率的重要因素，每个因素均被分为3个水平（料液比1∶5、1∶10、1∶15，蒸馏时间3、4、5 h，KCl浓度10%、15%、20%）以优化提取过程。2.2挥发油的GC-MS检测在GC-MS分析之前，将30 μL挥发油加入到1 mL正己烷中，然后经0.45 μm微孔滤膜过滤，制成测试溶液。使用7890B/5977B型GC-MS仪，通过GC-MS程序对北沙参茎叶挥发油和根挥发油的化学成分进行分析。采用NIST 17.0质谱数据库（https：//webbook.nist.gov/chemistry/）进行化合物检索（设置匹配度＞80%），采用峰面积归一化法求得各化学成分的相对百分含量。质谱条件：采用离子源，电子能量为70 eV，离子源温度为230 ℃，四极杆温度为150 ℃，溶剂延迟为3 min，质量扫描范围质荷比（m/z）为50→500。检测程序如下：载气为氦气（纯度99.999%），分流比为50∶1，流速为1 mL/min，样品体积为1 μL。升温程序如下：初始温度为60 ℃，持续1 min；然后以8 ℃/min的速度升至110 ℃，保持5 min；继续以8 ℃/min的速度升至250 ℃，保持5 min；最后以20 ℃/min的速度升至280 ℃，保持10 min。2.3抗真菌活性的测定采用纸片扩散法[16]测定北沙参茎叶挥发油和根挥发油对茄病镰刀菌、半裸镰刀菌、尖孢镰刀菌、寄生曲霉、黄曲霉的抗真菌活性。将被测真菌在28 ℃黑暗条件下培养7 d，待菌丝布满培养皿后，在距离中心2 cm处打孔，将每个真菌在超净工作台制成直径为6 mm的圆形菌块。将菌块放入新配制的马铃薯葡萄糖琼脂培养基（马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂15 g、蒸馏水1 L）的中心。用打孔机将定性滤纸制成直径6 mm的圆盘。将3张已灭菌的滤纸片从3个方向与真菌块等距离放置，处理组每张滤纸片加入5 μL挥发油，对照组用等量的二甲基亚砜代替挥发油，将处理组（包括茎叶挥发油组和根挥发油组）和对照组在28 ℃黑暗中培养3 d，观察其生长情况，使用相机记录抗真菌实验结果。用标尺测量抑菌圈后，将数据导入Image J 1.8.0软件，记录其抑菌圈的直径，分别记为IC处理和IC对照，抑菌圈直径越大表示抗菌效果越好。实验重复3次。最后计算菌丝抑制率，菌丝抑制率（%）＝（IC对照－IC处理）/（IC对照－6 mm）×100%。由于北沙参根的抑菌效果并不显著，较茎叶抑菌效果相差较大，故以北沙参茎叶挥发油为实验对象开展倍半稀释实验。为进一步明确北沙参茎叶挥发油的抗真菌活性，将茎叶挥发油分别用二甲基亚砜稀释成4个浓度梯度（100%、50%、25%、12.5%），真菌对照组滤纸片上加入5 μL二甲基亚砜，用同样的公式分别计算菌丝抑制率。2.4统计学分析采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，计量资料以 x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。3结果与分析3.1挥发油提取工艺的优化单因素实验结果显示，处理1组、处理2组、处理3组（20%KCl溶液）与对照组的挥发油提取率分别为（0.202±0.010）、（0.434±0.020）、（0.514±0.030）、（0.362±0.050） g/kg，处理3组与其他组进行比较，其挥发油提取率显著升高（P＜0.05）。将10%、15%、20%的KCl溶液作为提取溶剂，进一步考察不同浓度的KCl溶液对提取挥发油是否有显著性差异，结果显示，15%KCl溶液下挥发油提取率[（0.573±0.010） g/kg]显著高于10%KCl[（0.512±0.010） g/kg）]和20%KCl[（0.519±0.010） g/kg）]溶液的提取率（P＜0.05）。可见，利用盐溶液辅助提取挥发油可以加速挥发油从北沙参细胞壁的渗出，降低挥发油在水中的溶解度，减少挥发油中某些成分被水溶解，此方法可显著提高挥发油的产量[17]。但当KCl加入过量时，KCl的加入可能会引起提取物中可溶性物质增加，使溶液沸点升高，从而降低挥发油的提取率[18]。L9（34）正交实验结果显示，北沙参最佳工艺为料液比1∶15，蒸馏时间5 h，KCl浓度15%，详见表1。在此基础上对各因素进行方差分析，结果显示，在3个因素中，KCl浓度对挥发油提取率的影响最大，但KCl浓度对挥发油提取率的影响与其他因素差异无统计学意义（P＞0.05），详见表2。为进一步确定北沙参挥发油对提取工艺的可靠性与稳定性，在此条件下，进行3次工艺验证，结果显示，北沙参茎叶挥发油和根挥发油的提取率分别为（0.933±0.017）、（1.365±0.023） g/kg，RSD均小于2.00%，说明该工艺合理、稳定、重现性较好。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.11.14.T001表1正交实验结果编号料液比蒸馏时间/hKCl浓度挥发油提取率/（g/kg）11110.51121220.55631330.38142120.45852230.43662310.53973130.37583210.67593320.767K11.4481.3441.725K21.4331.2311.781K31.8171.6871.192R0.3840.4560.58910.6039/j.issn.1001-0408.2023.11.14.T002表2方差分析结果因素离差平方和自由度均方FP误差0.01120.006料液比0.03220.0162.7970.263蒸馏时间0.02520.0122.1920.313KCl浓度0.07020.0356.2490.1383.2北沙参茎叶和根挥发油的GC-MS分析采用GC-MS数据和NIST 17.0数据库，鉴定北沙参茎叶和根挥发油所含成分，结果见图1。由图1可知，从北沙参茎叶挥发油中共鉴定出11种成分，占总油量的77.44%，主要由人参炔醇（38.21%）和α-伞花素-15-醇（14.32%）组成，其次为14-羟基-α-木榄烯（4.92%）、水芹醛（3.96%）、植物醇（3.55%）。此外，茎叶挥发油还含有一定的桧烯（2.74%）、新植二烯（2.72%）、胡萝卜醇（2.38%）和大根香叶烯B（2.17%），它们均超过了北沙参茎叶挥发油总油量的2%，其余成分的含量较低，每一种均低于茎叶挥发油含量的1.30%。北沙参茎叶挥发油化学成分鉴定结果见表3。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.11.14.F001图1北沙参茎叶和根中挥发油的GC-MS图注：图中数字表示鉴定出的成分10.6039/j.issn.1001-0408.2023.11.14.T003表3北沙参茎叶挥发油化学成分鉴定结果编号成分保留时间/min物质数字识别号码相对峰面积百分比/%1桧烯6.21928634-89-12.742水芹醛12.41021391-98-03.963甲基丁香酚16.77393-15-21.244大根香叶烯B20.73715423-57-12.175α-伞花素-15-醇20.841115728-41-114.326石竹素21.3861139-30-61.237胡萝卜醇21.765127-40-22.38814-羟基-α-木榄烯22.569135118-51-34.929新植二烯31.468504-96-12.7210人参炔醇38.02181203-57-838.2111植物醇39.650150-86-73.55从北沙参根挥发油中共鉴定出8种成分，占总油量的88.77%，主要由人参炔醇（74.02%）组成。此外，北沙参根挥发油中出现了中等水平的亚油酸乙酯（4.05%），其次是反式-2，4-癸二烯醛（2.59%），其他成分含量均低于根挥发油总油量的2%。北沙参根挥发油化学成分鉴定结果见表4。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.11.14.T004表 4北沙参根挥发油化学成分鉴定结果编号成分保留时间/min物质数字识别号码相对峰面积百分比/%1反式-2，4-癸二烯醛13.89925152-84-52.592（+）-β-氟乙烯17.01779120-98-20.8733，3-二甲基-3H-吲唑19.31659341-22-91.694桉油烯醇21.2576750-60-31.775（S）-竹节参炔A36.6101242413-82-61.956棕榈酸乙酯36.947628-97-71.837人参炔醇38.14681203-57-874.028亚油酸乙酯41.311544-35-44.05除人参炔醇外，北沙参茎叶挥发油与根挥发油所含成分并不相同，人参炔醇是茎叶挥发油和根挥发油的共同成分，也是二者中含量最高的成分。北沙参茎叶挥发油的成分和比例比根更复杂，这也可能导致它们具有不同的生物活性。3.3北沙参茎叶和根挥发油的抗真菌活性分析抗真菌活性分析结果显示，北沙参茎叶挥发油和根挥发油在100%浓度时，对茄病镰刀菌、半裸镰刀菌、尖孢镰刀菌、寄生曲霉、黄曲霉均有抑制作用，茎叶挥发油的抑菌率为31.00%～100%，根挥发油的抑菌率为19.59%～54.67%。与根挥发油相比，茎叶挥发油对所测真菌表现出较高的抑菌活性（P＜0.05）。实验结果见图2、表5。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.11.14.F002图2北沙参茎叶和根挥发油的抑菌效果图10.6039/j.issn.1001-0408.2023.11.14.T005表5北沙参茎叶和根挥发油的抑菌率（x±s，n＝3，%）菌种茎叶挥发油根挥发油茄病镰刀菌100a54.67±1.82半裸镰刀菌74.07±2.55a50.79±0.79尖孢镰刀菌50.70±5.72a19.59±0.69寄生曲霉52.87±1.14a43.21±0.08黄曲霉31.00±1.76a26.41±0.55a：与根挥发油组比较，P＜0.05倍半稀释实验结果显示，北沙参茎叶挥发油对茄病镰刀菌的抑制作用最显著，在其浓度为25%时，对茄病镰刀菌仍能表现出完全抑制作用。25%的北沙参茎叶挥发油对其他真菌的抑制作用，从大到小依次为半裸镰刀菌、寄生曲霉、尖孢镰刀菌、黄曲霉。北沙参茎叶挥发油对黄曲霉的抑制作用较低，在挥发油浓度为50%时，已无抑制作用。随着茎叶挥发油浓度的降低，其对半裸镰刀菌、尖孢镰刀菌、寄生曲霉的抑制率逐步下降，可见茎叶挥发油对以上真菌的抑制作用具有剂量依赖趋势。结果见表6。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.11.14.T006表6倍半稀释茎叶挥发油后的抑菌率（x±s，n＝3，%）茎叶挥发油浓度/%茄病镰刀菌半裸镰刀菌尖孢镰刀菌寄生曲霉黄曲霉10010074.07±2.5550.70±5.7252.87±1.1431.00±1.765010061.90±4.1941.81±6.4133.33±6.0802510052.38±3.1723.23±5.0424.90±3.51012.546.19±3.6548.67±0.9114.34±1.3921.83±2.2904讨论本研究结果显示，北沙参的茎叶和根中均含有丰富的挥发油，用15%的KCl在料液比为1∶15条件下提取5 h，能显著提高茎叶和根中挥发油提取率。北沙参茎叶和根中所含挥发油明显不同，人参炔醇是两者的共有成分，也是含量最高的成分，其在茎叶挥发油和根挥发油中的含量分别达38.21%和74.02%，两者中的其余成分均不相同。北沙参茎叶挥发油和根挥发油对茄病镰刀菌、半裸镰刀菌、尖孢镰刀菌、寄生曲霉与黄曲霉均表现出一定的抗真菌活性，但根挥发油抑制作用较弱，茎叶挥发油对茄病镰刀菌和半裸镰刀菌表现出较强的抗真菌作用，且具剂量依赖趋势。黄曲霉和寄生曲霉等曲霉属真菌产生的毒素，具有致畸、致癌、致突变等作用，被认为是自然界中危害性最大的生物毒素之一[19]。镰刀菌属具有致病范围广和致病能力强等特点，是世界公认的重要真菌病害之一[20]。北沙参茎叶挥发油对以上真菌具有较好的抑制作用，具有良好的应用前景。综上所述，北沙参茎叶挥发油和根挥发油的化学成分差异明显，但二者均具有一定的体外抗真菌活性。