白芷为我国大宗常用药材，来源于伞形科植物白芷Angelica dahurica（Fisch. ex Hoffm.）Benth. et Hook. f. 或杭白芷A. dahurica（Fisch. ex Hoffm.）Benth. et Hook.f. var. formosana（Boiss.）Shan et Yuan的干燥根[1]。白芷药性辛、温，具有解表散寒、祛风止痛之功效，临床可用于治疗偏头痛、慢性鼻窦炎、类风湿性关节炎等多种疾病[2―4]。当前，我国药用白芷有4种商品类型：杭白芷、川白芷、祁白芷和禹白芷，其分别主产于我国浙江杭州、四川遂宁、河北安国及河南禹州[5]。《中国植物志》英文版将杭白芷和川白芷归为一类，祁白芷和禹白芷归为一类，分别来源于白芷A. dahurica（Fisch. ex Hoffm.）Benth. et Hook. f. 的栽培变种杭白芷A. dahurica cv. ‘Hangbaizhi’和祁白芷A. dahurica cv. ‘Qibaizhi’[6]。传统认为，杭白芷因其“条粗，体重，质坚，气芳香浓郁”而质优于祁白芷[7―8]。现代药理学及药物化学研究表明，香豆素类成分为白芷的主要活性成分[9]，与其解表镇痛的功效密切相关[10]。2020年版《中国药典》以香豆素类成分欧前胡素作为单一指标对白芷进行质量评价[1]。陈琳等[11]和吴宝成等[12]分别基于5～9种香豆素类成分的含量对不同产地的白芷质量进行了评价，但研究结果存在一定差异。目前从白芷中分离出的香豆素类成分多达50多种[9]，仅以1种或几种特定香豆素类成分作为质量评价指标不符合中药整体性的特点，也无法体现不同基原白芷的质量差异。因此，有必要对两种基原白芷的整体香豆素类成分进行系统分析。本研究采用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱联用（UPLC-Q-Exactive-MS/MS）的非靶向代谢组学技术分析杭白芷和祁白芷的香豆素类成分，运用主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘法判别分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）和正交偏最小二乘法判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）方法对得到的香豆素类成分进行鉴定并筛选差异成分，进而对不同基原的白芷进行聚类分析，寻找对两种基原白芷质量差异贡献最大的香豆素类成分，以期为白芷的来源鉴别、质量评价以及综合开发利用提供科学依据。1材料1.1主要仪器本研究所用主要仪器包括MS105DU型电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）、Centrifuge-5424R型冷冻离心机（德国Eppendorf公司）、Wonbo-96c型高通量组织破碎仪（上海万柏生物科技有限公司）、LNG-T88型台式快速离心浓缩干燥器（太仓市华美生化仪器厂）、JXDC-20型氮气吹扫仪（上海净信实业发展有限公司）、Vanquish Horizon型UHPLC液相色谱系统和Q-Exactive型质谱仪系统（美国Thermo Fisher Scientific公司）。1.2主要药品与试剂从四川、河南、河北等地采集了杭白芷A. dahurica cv. ‘Hangbaizhi’与祁白芷A. dahurica cv. ‘Qibaizhi’根部材料共18份（来源信息见表1），采集时间为2019年（杭白芷采收期为6月中下旬－7月上旬，祁白芷采收期为8－9月），将其根部材料自然风干并储存于南方医科大学中医药学院标本馆。上述样品均由南方医科大学中医药学院田恩伟副教授鉴定，均为真品。实验用试剂均购自美国Thermo Fisher Scientific公司，甲醇、乙腈为质谱纯，水为超纯水。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.12.03.T001表1白芷药材来源信息样品批次产地采集地点经纬度基原植物鉴定品种编号S1～S6四川广元N：31°56′38″；E：105°38′39″杭白芷HBZS7～S12河南禹州N：34°12′01″；E：113°34′32″祁白芷QBZS13～S18河北安国N：38°25′11″；E：115°19′37″祁白芷QBZ2方法与结果2.1供试品溶液的制备取两种基原的白芷样品粉末50 mg，放入1.5 mL离心管中，加入400 μL提取液（乙腈与甲醇的体积比为1∶1），涡旋混匀30 s后，低温超声提取30 min（5 ℃，40 kHz），静置30 min（－20 ℃），于4 ℃下以13 000×g离心15 min；取上清液，用氮气吹干，再用120 μL复溶液（乙腈与水的体积比为1∶1）复溶，低温超声萃取5 min（5 ℃，40 kHz），再于4 ℃下以13 000×g离心5 min，取上清液作为供试品溶液。2.2色谱条件色谱柱为BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.8 µm）；以水（含0.1%甲酸）为流动相A，乙腈-异丙醇溶液（体积比为1∶1，含0.1%甲酸）为流动相B进行梯度洗脱（0～3.0 min，95%A→80%A；3.0～9.0 min，80%A→5%A；9.0～13.0 min，5%A；13.0～13.1 min，5%A→95%A；13.1～16.0 min，95%A）；流速为0.40 mL/min；柱温为40 ℃；进样量为10 μL。2.3质谱条件采用正负离子扫描模式，质量扫描范围（m/z）为50～1 000；离子喷雾电压中正离子电压为5 000 V，负离子电压为4 000 V，去簇电压为80 V；喷雾气压力为50 psi，辅助加热气压力为50 psi，气帘气压力为30 psi；离子源加热温度为500 ℃；循环碰撞能为20～60 V。2.4数据处理与统计分析取供试品溶液适量，按“2.2”“2.3”项下色谱和质谱条件进样分析，将原始的质谱数据导入代谢组学处理软件Progenesis QI中进行基线过滤、峰识别和积分、保留时间校正、峰对齐，最终得到一个保留时间、质荷比和峰强度的数据矩阵。数据矩阵用80%规则来去除缺失值，再进行空缺值填补。为减小样品制备及仪器不稳定带来的误差，本研究将总峰归一化后取其对数值用于后续分析。将预处理后的数据矩阵导入人类代谢组数据库（the Human Metabolome Database，HMDB）化学小分子数据库（https：//hmdb.ca/）进行成分鉴定分类，筛选出两种基原白芷中的香豆素类成分；将鉴定所得的数据导入SIMCA 14.1软件进行无监督的PCA和有监督的PLS-DA、OPLS-DA多元统计分析，使用200次循环交互验证来评估模型的稳定性。基于OPLS-DA模型得到的变量重要性投影（variable importance in projection，VIP）和SPSS 26.0软件进行t检验得到的P值，以VIP值＞1.0、P＜0.05的成分为差异成分；再根据差异成分，用SPSS 26.0软件对两种基原白芷作聚类分析，以检查所筛得差异成分的可靠性。2.5白芷香豆素类成分鉴定根据HMDB化学小分子数据库的分析结果，本研究在2种基原白芷中共筛选鉴定出41种香豆素类成分，在负离子模式下有22种，在正离子模式下有19种。成分详细信息见表2。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.12.03.T002表2白芷香豆素类成分鉴定结果序号离子模式保留时间/min成分名称分子式m/z1负离子1.311 5异紫花前胡内酯半乳糖苷C20H24O9445.092 264 7152正离子1.429 4trans-grandmarinC15H16O6337.093 060 1093正离子1.650 1伞形花内酯C9H6O3163.038 399 5674正离子1.664 27-乙酰氧基-6-甲氧基香豆素C12H10O5235.059 122 4945正离子1.959 4香豆素C9H6O2147.043 578 0956负离子2.055 66-甲酰基伞形花内酯C10H6O4235.024 315 4097负离子2.071 83″-chloro-3″-deoxytriphasiolC19H23ClO5403.070 279 7668负离子2.087 17-羟基-6-甲基-2H-1-苯并吡喃-2-酮C10H8O3221.044 848 5039正离子2.178 8补骨脂素C11H6O3187.038 362 10910负离子2.179 3apterinC20H24O10423.129 902 45611负离子2.306 2rutaretin 9-rutinosideC26H34O14615.193 206 65312负离子2.338 1a东莨菪素C10H8O4191.034 142 59113负离子2.338 1a4-甲基伞形花内酯C10H8O3221.045 012 81914正离子2.360 7洋芹素C14H14O5263.090 440 45315负离子2.450 78H-1，3-dioxolo[4，5-h][1]benzopyran-8-oneC10H6O4235.024 390 32216正离子2.608 0marminalC16H16O4586.247 614 78617负离子2.720 13-（1，1-二甲基烯丙基）东莨菪内酯C15H16O4259.097 369 98018正离子2.791 0柠檬油素C11H10O4207.064 530 37319负离子2.816 6佛手酚C11H6O4247.024 552 64920正离子2.960 4（R）-异当归素3′-葡萄糖苷C23H28O12519.145 760 43321正离子3.098 1秦皮乙素C9H6O4201.017 578 35622负离子3.177 0a瑞香甲醚C20H14O7411.075 386 12923负离子3.177 0a异紫花前胡内酯鼠李糖苷C20H24O8437.145 806 75024负离子3.392 69-羟基-4-甲氧基补骨脂素C12H8O5231.029 451 94125负离子3.409 1轻叶黄素C20H24O10423.129 827 40426正离子3.429 0mukurozidiolC17H18O7669.215 743 35427正离子3.655 9尿石素AC13H8O4229.048 714 40128负离子3.711 07-甲氧基-5-丙炔氧基香豆素C15H16O4305.103 044 64529负离子3.810 4肉桂酮C14H12O4289.071 919 64630正离子3.914 25-去邻甲基甲苯二羟酚C15H16O5277.106 043 28831负离子4.149 4（R）-apiumetinC14H12O4289.071 898 52732正离子4.152 0氧化前胡素C16H14O5287.090 231 78733正离子4.152 0佛手苷内酯C12H8O4217.048 712 83434负离子4.318 5a异紫花前胡内酯芸香糖苷C26H34O13535.182 327 34035负离子4.318 5a9-羟基-4-甲氧基补骨脂素9-葡萄糖苷C18H18O10431.040 862 73636负离子5.330 3aegelinolC14H14O4227.070 987 40037正离子5.531 34-hydroxy-8-methoxy-2H-furo[2，3-h]-1-benzopyran-2-oneC12H8O5233.043 408 68738正离子5.645 5白当归素C17H18O7335.110 908 63039负离子5.711 9欧前胡素C16H14O4539.171 172 13340正离子5.985 6（R）-pabulenolC16H14O5573.173 518 19141正离子8.465 53-羟基香豆素C9H6O3163.038 395 251a：保留时间经修约后相同2.6香豆素类成分的多元统计分析PCA得分图（图1）和PLS-DA得分图（图2）的x轴累积解释率均大于0.5，说明两种模型拟合准确性高；图中杭白芷与祁白芷的样品点均在置信区间内，且两种基原白芷的样品点能明显分离，说明两种基原白芷的香豆素类成分存在明显差异。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.12.03.F001图1杭白芷与祁白芷的香豆素类成分PCA得分图10.6039/j.issn.1001-0408.2023.12.03.F002图2杭白芷与祁白芷的香豆素类成分PLS-DA得分图OPLS-DA得分图见图3。置换验证结果显示，累积解释率R 2X＝0.613，R 2Y＝0.981，Q 2＝0.957，说明OPLS-DA模型有较好的准确性、可靠性和预测能力。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.12.03.F003图3杭白芷与祁白芷香豆素类成分OPLS-DA得分图2.7两种基原白芷的香豆素类差异成分筛选杭白芷与祁白芷的41种香豆素类成分中共有23种为差异成分，占比56.1%，结果见表3。在23种香豆素类差异成分中，6种在杭白芷中含量更高，其余17种在祁白芷中含量更高，其中异紫花前胡内酯半乳糖苷在杭白芷中的含量显著高于祁白芷（log2FC＞2.0）。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.12.03.T003表3杭白芷与祁白芷的香豆素类差异成分序号成分名称PVIPlog2FC1异紫花前胡内酯半乳糖苷＜0.0011.2682.97423-（1，1-二甲基烯丙基）东莨菪内酯＜0.0011.1250.7383trans-grandmarin＜0.0011.2270.54547-乙酰氧基-6-甲氧基香豆素＜0.0011.1880.49253″-chloro-3″-deoxytriphasiol＜0.0011.1790.2626（R）-pabulenol0.0011.0350.1097氧化前胡素＜0.0011.156－0.1308秦皮乙素＜0.0011.195－0.21198H-1，3-dioxolo[4，5-h][1]benzopyran-8-one＜0.0011.173－0.27510东莨菪素＜0.0011.236－0.29011洋芹素＜0.0011.265－0.30712aegelinol＜0.0011.104－0.35613（R）-apiumetin＜0.0011.239－0.37014补骨脂素＜0.0011.297－0.41215apterin＜0.0011.301－0.462167-甲氧基-5-丙炔氧基香豆素＜0.0011.065－0.51717异紫花前胡内酯鼠李糖苷0.0061.108－0.575184-甲基伞形花内酯＜0.0011.275－0.59419（R）-异当归素3′-葡萄糖苷＜0.0011.228－0.65520marminal＜0.0011.162－0.67021轻叶黄素＜0.0011.270－0.733227-羟基-6-甲基-2H-1-苯并吡喃-2-酮＜0.0011.275－0.78823rutaretin 9-rutinoside＜0.0011.273－1.167log2FC：差异倍数对数值，大于0表示该差异成分在杭白芷中含量更高，小于0表示该差异成分在祁白芷中含量更高2.8两种基原白芷的聚类分析聚类分析结果（图4）显示，6批杭白芷（S1～S6）聚为一类，12批祁白芷（S7～S18）聚为一类。这说明筛选出的23种香豆素类差异成分具有代表性，可作为白芷品种来源的判别依据。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.12.03.F004图4杭白芷与祁白芷的聚类分析图3讨论中药品种来源与药材质量密切相关，不同基原白芷的鉴别是当前白芷研究与应用中亟待解决的问题之一。《中国植物志》中虽描述了两种基原白芷根的形态差异[13]，但不同基原白芷间的典型性状特征并不稳定，有时依赖形态特征难以鉴别。黄璐琦[14]从形态解剖学的角度入手，也未发现两种基原白芷有明显的形态差异。本课题组前期通过多产地（群体）、大样本采样的方式，测定了4种商品白芷的核糖体DNA内转录间隔区序列，结果发现所有样本均为同一单倍型，采用DNA分子鉴定技术也不能很好地解决两种基原白芷的鉴别问题。但非靶向代谢组学技术可以系统地、较大限度地检测到药材中的多种代谢成分，使尽可能多的香豆素成分囊括其中。因此，本研究采用非靶向代谢组学技术结合多元统计分析方法，对杭白芷与祁白芷的香豆素类成分进行了鉴定及差异分析，结果共鉴定出41种香豆素类成分，有23种成分在两种基原白芷中存在显著差异，其中6种在杭白芷中的含量更高，其余17种在祁白芷中含量更高。前人研究发现，河北产的祁白芷中氧化前胡素含量及香豆素总量均高于浙江等产地的白芷[15]，与本研究结果一致。本研究又基于香豆素类成分对杭白芷与祁白芷进行了聚类分析，结果发现23种香豆素类差异成分能很好地区分杭白芷与祁白芷，其中异紫花前胡内酯半乳糖苷的贡献最大，在杭白芷中的含量显著高于祁白芷，今后可尝试将其用于两种基原白芷的鉴别。