头痛是一种高发慢性疾病，具体表现为眉棱骨以上至枕下部区域内的疼痛，具有缠绵难愈、反复发作的特点[1]。其病因复杂，病情轻重不一，严重影响患者正常生活。芎芷石膏汤出自《医宗金鉴·四十三卷》，由川芎、白芷、石膏、藁本、羌活及菊花组成。方中川芎为君药，亦为治疗头痛之要药，具有疏风止痛、破瘀行气之功效；白芷、石膏为臣药，具有清泻郁热、通络止痛之功效；藁本、羌活、菊花为佐药，其中藁本、羌活具有祛风散寒止痛之功效，菊花具有疏散风热之功效；六药配伍，共奏疏风散寒、清泻郁热、通络止痛之功效。文献报道芎芷石膏汤及其加味方可用于治疗各种类型头痛[2―4]。《医心方》提到“从内之外而盛于外者，先调其内而治其外；从外而盛于内者，先治其外而后调其内”[5]。可见，针对头痛这一病症，以外用法进行治疗是一种有效的方法。可溶性微针作为一种新型的中医药外用治疗手段，近年来受到国内外学者的广泛关注，已被用于治疗多种疾病，如支气管哮喘等[6]。可溶性微针由可溶性高分子材料与药物混合制备而成，针体刺入皮肤后，药物不受角质层的阻碍直达真皮层，然后溶解于组织液中发挥疗效，避免了药物对胃肠道的刺激性，也减少了肝脏对药物的首过消除，同时高分子材料可自行在体内降解[7]。基于此，本研究拟制备芎芷石膏汤可溶性微针，并进行表征和考察其体外透皮性能，旨在为芎芷石膏汤经皮制剂的研制提供实验依据。1材料1.1主要仪器Y26型PDMS阴模（针长600 μm，阵列20×20）购自台州薇芯医药科技有限公司；2695型高效液相色谱仪购自美国Waters公司；RYJ-6B型药物透皮扩散试验仪购自上海黄海药检仪器有限公司；CX22型生物显微镜（日本Olympus公司）；TGL18M型台式高速冷冻离心机购自湖南湘立科学仪器有限公司；AUW120D型十万分之一分析天平购自日本Shimadzu公司。1.2主要药品与试剂芎芷石膏汤干浸膏（批次分别为221008、221009、221010）由本实验室自制，按芎芷石膏汤处方比例称取川芎12 g、白芷9 g、石膏20 g、藁本12 g、羌活9 g、菊花9 g，以14倍量70%乙醇浸泡0.5 h后回流提取3次，每次1.5 h；合并滤液，于60 ℃减压浓缩至每毫升含生药量0.2 g，再以D101大孔树脂进行纯化，其中，上样液pH为3.0，上样量为2 BV（柱体积），上样流速为1 mL/min；再以4 BV酸水（pH3.0）同速洗脱除杂，最后以8 BV 90%乙醇同速洗脱目的成分；将洗脱液减压浓缩，60 ℃水浴蒸干，备用。绿原酸、阿魏酸、欧前胡素、异欧前胡素对照品（批号分别为110753-201817、110773-201614、110826-201214、110827-201410）均购自中国食品药品检定研究院，藁本内酯对照品（批号210729）购自上海融禾医药科技发展有限公司，羌活醇对照品（批号AF20082307）购自成都埃法生物科技有限公司，以上对照品纯度均不低于98%。硫酸软骨素（CS，批号C2291713）购自上海玻尔化学试剂有限公司；羟丙基甲基纤维素（HPMC，批号20180307）购自合肥巴斯夫生物科技有限公司；聚乙烯醇（PVA，批号P21501215）购自天津市风船化学试剂科技有限公司；聚乙烯吡咯烷酮 K30（PVP K30，批号01023）购自合肥博美生物科技有限公司；羧甲基纤维素钠（CMC-Na，批号20210518）购自上海申光食用化学品有限公司；明胶（批号20180420）购自天津市科密欧化学试剂有限公司；D101大孔吸附树脂（批号20220323）购自天津百伦斯生物技术有限公司；乙腈为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。1.3实验动物本研究所用动物为健康雄性SPF级SD大鼠，共10只，体质量170～190 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物生产许可证号为SCXK（京）2021-0011。所有动物实验均遵循山西中医药大学动物伦理委员会相关规定（批准号为AWE20220719）。2方法与结果2.1芎芷石膏汤可溶性微针的制备采用两步离心法制备芎芷石膏汤可溶性微针[8]。第1步，空白针尖层的制备：取500 mg CS、100 mg HPMC于烧杯中，加入1.2 mL水混匀，充分溶胀后浇注于微针模具中，以4 000 r/min离心15 min，刮去模具表面基质液只保留针尖部分，置于干燥器中干燥10 h，备用。第2步，含药背衬层的制备：称取400 mg PVA，溶于3.6 mL芎芷石膏汤溶液（取适量芎芷石膏汤干浸膏以40%乙醇溶解制成质量浓度为1.6 g/mL的溶液）中，充分溶胀后注入微针模具，相同条件下离心15 min，置于干燥器内干燥24 h，用弯镊小心脱模，即得芎芷石膏汤可溶性微针。参考文献[9]的综合评分法并进行优化，从基质溶液流动性、微针成形性、针尖硬度、气泡量、背衬韧性方面对所制备的3批芎芷石膏汤可溶性微针进行评分，当评分大于15时，表明所制备的微针具有良好的机械性能及成形性。评分结果见表1。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.13.10.T001表1不同批次芎芷石膏汤可溶性微针的评分结果（分）批次基质溶液流动性微针成形性针尖硬度气泡量背衬韧性总分2210081553317221009155331722101015533172.2芎芷石膏汤可溶性微针中活性成分含量测定方法的建立2.2.1色谱条件色谱柱为Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.085%磷酸溶液（B）（梯度洗脱：0～5 min，1%A→15%A；5～15 min，15%A→18%A；15～25 min，18%A→30%A；25～35 min，30%A→54%A；35～60 min，54%A→60%A；60～65 min，60%A→1%A）；检测波长为310 nm；流速为0.8 mL/min；柱温为25 ℃；进样量为10 μL。2.2.2溶液的制备（1）对照品溶液的制备：分别精密称取绿原酸、阿魏酸、羌活醇、欧前胡素、藁本内酯、异欧前胡素对照品适量，加甲醇制成各成分质量浓度分别为0.450、0.364、0.976、0.412、0.807、1.144 mg/mL的单一对照品溶液。取各单一对照品溶液适量，置于同一容量瓶中，加甲醇制成各成分质量浓度分别为0.045 0、0.036 4、0.097 6、0.041 2、0.080 7、0.114 4 mg/mL的混合对照品溶液。（2）供试品溶液的制备：将制备好的芎芷石膏汤可溶性微针溶于2 mL甲醇中，超声（功率200 W，频率40 kHz，下同）提取1 h，以8 000 r/min离心10 min，取上清液，定容于2 mL容量瓶中，以0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。（3）空白微针溶液的制备：取一片空白微针溶于2 mL甲醇中，超声提取1 h，以8 000 r/min离心10 min，取上清液，定容于2 mL容量瓶中，以0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。2.2.3专属性考察将“2.2.2”项下制备的3种溶液按“2.2.1”项下方法进样测定，记录色谱图。结果显示，6种成分与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，理论板数按绿原酸计不低于3 000。结果见图1。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.13.10.F001图1专属性考察的高效液相色谱图1：绿原酸；2：阿魏酸；3：羌活醇；4：欧前胡素；5：藁本内酯；6：异欧前胡素。2.2.4线性关系考察精密吸取“2.2.2（1）”项下混合对照品溶液适量，加甲醇稀释并制备成绿原酸质量浓度分别为4.5、9.0、18.0、22.5、36.0、45.0 μg/mL，阿魏酸质量浓度分别为3.64、7.28、14.56、18.20、29.12、36.40 μg/mL，羌活醇质量浓度分别为9.76、19.52、39.04、48.80、78.08、97.60 μg/mL，欧前胡素质量浓度分别为4.12、8.24、16.48、20.60、32.96、41.20 μg/mL，藁本内酯质量浓度分别为8.07、16.14、32.28、40.35、64.56、80.70 μg/mL，异欧前胡素质量浓度分别为11.44、22.88、45.76、57.20、91.52、114.40 μg/mL的系列混合对照品溶液。取各系列混合对照品溶液按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，以各对照品峰面积为纵坐标（Y）、质量浓度为横坐标（X）进行线性回归。结果见表2。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.13.10.T002表26种成分线性关系考察结果成分回归方程r线性范围/（μg/mL）绿原酸Y＝43 747X－1 51230.999 54.5～45.0阿魏酸Y＝69 482X－2 646.90.999 83.64～36.40羌活醇Y＝55 483X－7 291.40.999 89.76～97.60欧前胡素Y＝41 669X+3 551.20.999 94.12～41.20藁本内酯Y＝19 345X+2 261.30.999 68.07～80.70异欧前胡素Y＝55 227X+56 1590.999 611.44～114.402.2.5精密度试验取“2.2.2（1）”项下混合对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果显示，6种成分峰面积的RSD分别为1.26%、0.45%、0.74%、0.92%、1.30%、0.75%（n＝6），表明仪器精密度良好。2.2.6重复性试验取同一批（批次221008）芎芷石膏汤可溶性微针6片，按“2.2.2（2）”项下方法制备供试品溶液后按“2.2.1”项下色谱条件连续进样，记录峰面积，并根据外标法计算6种成分含量。结果显示，6种成分含量的RSD分别为1.19%、1.36%、0.71%、1.06%、1.31%、1.25%（n＝6），表明该方法重复性良好。2.2.7稳定性试验取芎芷石膏汤可溶性微针（批次221008）1片，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在室温下放置0、2、4、8、12、24 h时按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果显示，6种成分峰面积的RSD分别为1.48%、0.83%、1.45%、0.41%、1.33%、1.44%（n＝6），表明该供试品溶液在室温放置24 h内稳定性良好。2.2.8加样回收率试验取已知各成分含量的芎芷石膏汤可溶性微针6片，分别截取一半，保证各半质量一致，按样品含量与对照品含量1∶1的比例精密加入各对照品，按“2.2.2（2）”项下方法制成供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算加样回收率。结果显示，6种成分的平均加样回收率分别为100.74%、99.62%、100.41%、102.32%、101.72%、100.17%，RSD分别为1.45%、1.63%、1.74%、1.25%、1.74%、1.70%（n＝6），表明该方法准确度良好。2.3芎芷石膏汤可溶性微针的表征2.3.1外观形态观察通过肉眼和显微镜观察所制备的芎芷石膏汤可溶性微针的形态学特征，结果显示，该微针阵列为20×20，间距为700 μm，针尖呈圆锥形，分布均匀且粗细相同，针长为600 μm。结果见图2。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.13.10.F002图2微针外观形态2.3.2机械强度考察（1）铝箔穿刺实验：将制备好的芎芷石膏汤可溶性微针针尖向下放置，垂直刺入铝箔，以一定力度按压2 min后，置于显微镜下观察刺穿铝箔的情况。结果显示，该微针可完全刺穿铝箔，且孔隙排列整齐，表明该微针的机械性能良好（图略）。（2）皮肤穿刺实验：将SD大鼠断颈处死后，立即将腹部毛发剃除干净，剪取腹部皮肤，剥离脂肪组织和筋膜；以生理盐水清洗干净后，用滤纸吸干水分，锡箔纸包裹鼠皮，置于－80 ℃冰箱中冻存。使用前，将鼠皮用生理盐水浸泡30 min，再以滤纸吸干表面水分，用一定力度将微针垂直刺入鼠皮中，作用2 min后取出，立即用0.4%亚甲基蓝溶液均匀地铺满微针刺过的皮肤部位，放置10 min；以脱脂棉球吸净皮肤表面亚甲基蓝溶液，再用生理盐水浸湿的棉球轻轻擦拭皮肤上的染料，并通过肉眼和显微镜观察鼠皮表面针刺部位的染色情况。结果显示，该微针能成功刺穿鼠皮，皮肤上呈现出排列整齐、规则的蓝色圆点，表明针尖机械强度好。结果见图3。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.13.10.F003图3芎芷石膏汤可溶性微针刺穿皮肤的情况2.3.3溶解性能考察将4只健康SD大鼠麻醉后，剔除背部毛发并涂抹脱毛膏去除残余毛发。取4片芎芷石膏汤可溶性微针在同一时间用相同力度垂直作用于大鼠背部皮肤，分别在0、0.5、1、2 h时拔出，采用显微镜观察该微针刺入大鼠皮肤后的溶解情况。结果显示，该微针在刺入大鼠皮肤2 h后针尖部分几乎全部溶解。结果见图4。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.13.10.F004图4芎芷石膏汤可溶性微针作用于皮肤不同时间后的形态（×10）2.3.4皮肤屏障恢复性能考察皮肤角质层孔道的闭合情况被认为是评估皮肤角质层恢复情况的指标[10]。将SD大鼠麻醉后，剔除背部毛发并涂抹脱毛膏去除残余毛发，将芎芷石膏汤可溶性微针以一定力度垂直压入大鼠背部皮肤，作用5 min后拔出，然后观察皮肤的恢复情况。结果显示，微针拔出后，可在大鼠皮肤表面观察到排列规则的针孔。恢复1 h后，微针刺入的皮肤部位几乎看不到针孔，与周围的皮肤纹理一致，角质层孔道完全闭合，表明所制微针具有较好的溶解性，对皮肤无明显损伤。结果见图5。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.13.10.F005图5芎芷石膏汤可溶性微针作用后皮肤的恢复情况2.3.5芎芷石膏汤可溶性微针载药量测定将5片芎芷石膏汤可溶性微针按“2.2.2（2）”项下方法制备供试品溶液后过0.45 μm微孔滤膜，按“2.2.1”项下色谱条件进样分析，然后按外标法计算每片微针的载药量。结果显示，每片芎芷石膏汤可溶性微针中绿原酸、阿魏酸、羌活醇、欧前胡素、藁本内酯、异欧前胡素的载药量分别为（87.04±1.12）、（67.69±1.23）、（20.65±0.17）、（35.00±0.11）、（153.83±0.21）、（23.52±0.50） μg。2.4芎芷石膏汤可溶性微针的体外透皮实验利用Franz透皮扩散池法进行芎芷石膏汤可溶性微针的体外透皮性能研究。首先向接收室内注入含70%乙醇的生理盐水作为接收液（预实验考察确定），温度维持在（37±0.5） ℃；芎芷石膏汤可溶性微针组用一定力度将微针垂直作用于离体鼠皮2 min后，将鼠皮连同微针一起置于接收室上，保证皮肤角质层朝上，皮肤组织接触接收液；另将等量含药基质液（精密称定与微针等量的药液与基质液，搅拌均匀）置于另一块离体鼠皮上，除不按压外其余操作相同，作为对照组。实验开始时，设置300 r/min的转速模拟人体皮肤下血液和组织液内循环，分别于0、1、2、4、8、12、24、36、48、72 h时收集全部接收液，于40 ℃水浴蒸干后，残渣用接收液溶解并定容至2 mL容量瓶中，经0.22 μm微孔滤膜滤过后，按“2.2.1”项下色谱条件进样分析，每次取样完成后需立即补足等量接收液。采用GraphPad Prism 8.0.1软件绘制芎芷石膏汤可溶性微针中6种成分的累积释放曲线，采用OriginPro 2018C软件进行释放模型的拟合，结果见图6、表3。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.13.10.F006图6芎芷石膏汤可溶性微针中6种成分的累积释放曲线Q：累积释放率。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.13.10.T003表3芎芷石膏汤可溶性微针中6种成分经皮释放的拟合方程成分零级方程一级动力学方程Higuchi方程拟合方程R2拟合方程R2拟合方程R2绿原酸Q＝0.58t+0.850.912 9Q＝57.57（1－e－0.02t）0.981 0Q＝6.15t1/2－12.500.960 5阿魏酸Q＝0.78t+12.120.745 9Q＝61.34（1－e－0.04t）0.958 5Q＝8.69t1/2－7.600.885 9羌活醇Q＝0.27t+3.660.766 8Q＝21.98（1－e－0.03t）0.945 7Q＝3.05t1/2－3.800.894 3欧前胡素Q＝0.81t+10.300.768 8Q＝66.76（1－e－0.03t）0.940 5Q＝9.29t1/2－12.370.895 1藁本内酯Q＝0.17t+1.490.675 7Q＝13.39（1－e－0.03t）0.851 3Q＝1.97t1/2－3.370.816 2异欧前胡素Q＝0.50t+5.650.779 3Q＝40.98（1－e－0.03t）0.939 3Q＝5.70t1/2－8.230.903 5e：自然对数的底数，其值约为2.72。由图6、表3可知，芎芷石膏汤可溶性微针中绿原酸、阿魏酸、羌活醇、欧前胡素、藁本内酯、异欧前胡素72 h的累积释放率分别为36.94%、56.72%、19.36%、57.98%、11.06%、35.19%，而含药基质液中上述成分的累积释放率极低；进一步通过比较R2大小可知，芎芷石膏汤可溶性微针的体外透皮释放符合一级动力学方程。3讨论芎芷石膏汤由川芎、白芷、石膏、藁本、羌活及菊花组成，《中国药典》（一部）中川芎和藁本均以阿魏酸为含量测定指标，但是藁本内酯亦为两种药材的主要活性物质，二者均具有不同程度的抗炎作用[11]。欧前胡素和异欧前胡素为白芷中香豆素类成分，具有镇痛抗炎、抗肿瘤等多种生物活性[12]。羌活醇作为羌活抗炎作用的质量标志物之一[13]，能抑制大鼠成纤维样滑膜细胞增殖[14]。绿原酸除能调节细胞凋亡外，还具有抗氧化、抗炎、抗菌等药理作用[15]。故本研究以阿魏酸、藁本内酯、欧前胡素、异欧前胡素、羌活醇、绿原酸为芎芷石膏汤可溶性微针质量的考察指标。本研究通过可溶性微针使皮肤形成释药孔洞，促进背衬层负载的药物逐渐在皮肤中溶解释放，这种微针结合了皮下注射和透皮贴片的双重释药特点，在保证大分子药物能被吸收的同时可减轻疼痛，提高患者顺应性。根据力学性能的不同，通常将高分子材料分为脆性材料和韧性材料两大类，脆性材料的机械性能过强容易导致碎裂，而韧性材料虽柔韧性良好但机械性能不足，研究表明，复合材料能很好地解决这一问题。因此，本研究最终将脆性材料CS和韧性材料HPMC复合作为针尖材料，使针尖的机械强度满足透皮的要求。体外透皮研究显示，对比含药基质液，芎芷石膏汤可溶性微针可促进药物透皮，微针中各活性成分在给药4 h时开始释放，在12～24 h时释放较快，之后趋于平缓；但各活性成分在72 h内的累积释放率普遍不高，产生此结果的原因可能与负载药物的背衬层材料的选择及载药方式有关。本研究选择的背衬材料PVA作为一种骨架型水溶性高分子材料，其在接触皮肤组织液后先发生溶胀进而释放药物，且PVA浓度越高，缓释作用越明显[8]。此外，由于本研究药物为中药复方可溶性微针，其中也含有除活性成分以外的成分，这类成分也有可能阻碍药物的释放。综上所述，本研究成功制备芎芷石膏汤可溶性微针，其成形性、机械性好，背衬柔韧，可促进药物透皮吸收。