灵芝为多孔菌科灵芝属真菌赤芝Ganoderma lucidum（Leyss. ex Fr.）Karst.或紫芝G. sinense Zhao，Xu et Zhang的干燥子实体，在我国分布广泛，主产于四川、山东、安徽、浙江等地。灵芝始载于《神农本草经》，收录于2020年版《中国药典》，是我国著名的滋补药材之一。现代研究表明，灵芝在肿瘤辅助治疗方面具有较好的疗效[1―2]，灵芝多糖和灵芝酸类成分是其主要的功效成分，其中灵芝酸类成分具有直接杀伤肿瘤细胞的作用[3―4]。灵芝多糖含量、灵芝酸总量是2020年版《中国药典》中灵芝质量控制的指标，然而紫外分光光度法的专属性不强，检测时易受皂苷、油酸等物质干扰，无法保证测得的总三萜酸含量准确度[5]。近年来，高效液相色谱（high-performance liquid chromatography，HPLC）法已成为测定酸类成分的主要手段之一，能有效解决专属性问题[6―7]。但灵芝酸类成分的对照品不易获得，价格昂贵，限制了HPLC法在灵芝酸类成分检测中的应用。一测多评（quantitative analysis of multi-components by single marker，QAMS）法是利用中药有效成分间的内在函数关系和比例关系，仅测定1种成分（对照品易得），来实现多种成分（对照品没有或难以供应）的同步监控[8]，该方法已广泛应用于中药的质量控制工作中[9―10]。2010年版《中国药典》首次在中药材黄连项下收载了QAMS法，2015年版《中国药典》增加至9个品种[11]，2020年版《中国药典》增加至16个品种[4]。本研究在前期建立的灵芝HPLC指纹图谱[12]基础上，拟采用QAMS法，以灵芝酸A为内参物，得到灵芝酸B、灵芝酸C2、灵芝酸D、灵芝酸F、灵芝酸H、灵芝烯酸A、灵芝烯酸B、灵芝烯酸C、灵芝烯酸D与灵芝酸A之间的相对校正因子，计算出这9种灵芝酸的含量，并与外标法（external standard method，ESM）比较，建立快捷、经济、全面的灵芝酸类成分含量测定的QAMS法，并对不同产地灵芝进行质量控制，为其质量标准修订提供参考。1材料1.1主要仪器本研究所用的主要仪器有Series Ⅲ型HPLC仪（美国SSI/ALLCHROM公司）、Waters 1525型HPLC仪（美国Waters公司）、AL104型分析电子天平[梅特勒·托利多仪器（上海）有限公司]等。1.2主要药品与试剂灵芝酸A、灵芝酸B、灵芝酸C2、灵芝酸D、灵芝酸F、灵芝酸H、灵芝烯酸A、灵芝烯酸B、灵芝烯酸C、灵芝烯酸D对照品（批号分别为PS000596、PS161017-04、PS000597、PS000598、PS00007068-802、PS00007063-816、PS161026-02、PS161021-01、PS010840、PS000604）均购自成都普思生物科技股份有限公司，纯度均在98%以上，可供含量测定用；乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯。实验用的30批灵芝样品信息见表1，经四川省中医药科学院罗霞研究员鉴定为真品。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.14.08.T001表130批灵芝样品来源信息编号基原产地编号基原产地S1G. lucidum四川S16G. lucidum安徽S2G. lucidum四川S17G. lucidum安徽S3G. lucidum四川S18G. lucidum安徽S4G. lucidum四川S19G. lucidum安徽S5G. lucidum四川S20G. lucidum安徽S6G. lucidum四川S21G. lucidum安徽S7G. lucidum四川S22G. lucidum浙江S8G. lucidum四川S23G. lucidum浙江S9G. lucidum四川S24G. lucidum浙江S10G. lucidum四川S25G. lucidum浙江S11G. lucidum山东S26G. lucidum浙江S12G. lucidum山东S27G. lucidum浙江S13G. lucidum山东S28G. lucidum吉林S14G. lucidum山东S29G. lucidum吉林S15G. lucidum山东S30G. lucidum吉林2方法与结果2.1色谱条件色谱柱为ZORBAX SB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈（A）-0.1%乙酸溶液（B）为流动相进行梯度洗脱（0～20 min，30%A→31%A；20～30 min，31%A；30～60 min，31%A→32%A；60～80 min，32%A→40%A；80～85 min，40%A；85～90 min，40%A→82%A）；进样体积为10 μL；检测波长为254 nm；柱温为30 ℃；流速为1.0 mL/min。2.2混合对照品溶液的制备分别精密称取灵芝酸A、灵芝酸B、灵芝酸C2、灵芝酸D、灵芝酸F、灵芝酸H、灵芝烯酸A、灵芝烯酸B、灵芝烯酸C、灵芝烯酸D对照品各适量，加入甲醇制成质量浓度分别为3.996、4.971、4.568、3.558、4.177、5.440、3.944、4.994、5.593、4.342 mg/mL的混合对照品溶液。2.3供试品溶液的制备取灵芝样品粉末（过20目筛）约1.0 g，精密称定，置于圆底烧瓶中，加入95%乙醇，加热回流提取2次，每次40 mL，提取60 min，滤过，合并滤液，减压干燥，加入1 mL甲醇使溶解，经微孔滤膜（0.45 μm）滤过，即得供试品溶液。2.4HPLC含量测定法的建立2.4.1系统适用性试验取上述混合对照品溶液、供试品溶液、空白对照溶液（甲醇），按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，详见图1（空白对照溶液图略）。由图1可知，灵芝酸A等10种成分的分离效果较好，空白对照溶液对测定无干扰。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.14.08.F001图1混合对照品溶液和灵芝样品溶液的HPLC色谱图1：灵芝烯酸C；2：灵芝酸C2；3：灵芝烯酸B；4：灵芝酸B；5：灵芝烯酸A；6：灵芝酸A；7：灵芝酸H；8：灵芝烯酸D；9：灵芝酸D；10：灵芝酸F。2.4.2线性关系考察分别精密吸取“2.2”项下的混合对照品溶液0.04、0.10、0.25、1.0、2.5、5.0 mL置于5 mL容量瓶中定容，制得6种不同质量浓度的混合对照品溶液。按照“2.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积，以峰面积（Y）为纵坐标、质量浓度（X）为横坐标作回归曲线方程，各成分在相应的质量浓度范围内线性关系良好。结果见表2。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.14.08.T002表210种灵芝酸类成分的线性关系考察结果对照品回归方程线性范围/（mg/mL）R 2灵芝酸AY＝3×106X－434 7330.032～3.9960.999 4灵芝酸BY＝5×106X－831 8800.040～4.9710.999 4灵芝酸C2Y＝4×106X－475 5930.037～4.5680.999 9灵芝酸DY＝3×106X－334 2750.028～3.5580.999 9灵芝酸FY＝5×106X－540 6510.033～4.1770.999 9灵芝酸HY＝3×106X－407 7940.044～5.4400.999 8灵芝烯酸AY＝2×106X－2×1060.032～3.9440.999 8灵芝烯酸BY＝1×107X－2×1060.040～4.9940.999 8灵芝烯酸CY＝2×107X－1×1060.045～5.5930.999 2灵芝烯酸DY＝1×107X－1×1060.035～4.3420.999 22.4.3精密度试验精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件重复进样6次，记录10种对照品的峰面积。结果显示，灵芝酸A、灵芝酸B、灵芝酸C2、灵芝酸D、灵芝酸F、灵芝酸H、灵芝烯酸A、灵芝烯酸B、灵芝烯酸C、灵芝烯酸D的峰面积RSD分别为1.64%、1.05%、0.89%、1.65%、1.08%、0.96%、1.66%、1.37%、0.81%、0.99%（n＝6），表明方法精密度良好。2.4.4稳定性试验取同一供试品溶液（编号S1），分别于0、2、4、8、16、24 h时按“2.1”项下色谱条件进样，记录峰面积。结果显示，灵芝酸A、灵芝酸B、灵芝酸C2、灵芝酸D、灵芝酸F、灵芝酸H、灵芝烯酸A、灵芝烯酸B、灵芝烯酸C、灵芝烯酸D的峰面积RSD分别为1.22%、1.65%、1.53%、0.98%、1.17%、0.67%、0.98%、1.28%、1.16%、1.45%（n＝6），表明供试品溶液在24 h内稳定。2.4.5重复性试验取同一批样品6份（编号S1），分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，测定并记录峰面积，按标准曲线法计算含量。结果显示，灵芝酸A、灵芝酸B、灵芝酸C2、灵芝酸D、灵芝酸F、灵芝酸H、灵芝烯酸A、灵芝烯酸B、灵芝烯酸C、灵芝烯酸D的含量RSD分别为1.35%、1.21%、1.68%、0.86%、1.07%、1.52%、1.42%、0.99%、0.65%、1.71%（n＝6），表明该方法重复性良好。2.4.6加样回收率试验取6份已知含量的同一样品粉末（编号S1）1.0 g，精密称定，按1∶1的比例精密加入各对照品溶液，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，测定并记录峰面积，计算加样回收率。结果显示，灵芝酸A、灵芝酸B、灵芝酸C2、灵芝酸D、灵芝酸F、灵芝酸H、灵芝烯酸A、灵芝烯酸B、灵芝烯酸C、灵芝烯酸D的平均加样回收率分别为99.43%、100.25%、98.50%、99.88%、100.59%、99.64%、98.50%、99.40%、99.64%、99.76%，RSD分别为1.20%、1.41%、0.83%、1.10%、1.09%、1.11%、0.96%、0.71%、0.93%、0.95%（n＝6），表明该方法准确度良好。2.5QAMS法的建立2.5.1相对校正因子计算取混合对照品溶液分别进样2、4、6、8、10、20 μL，测定并记录峰面积。以性质稳定、价廉易得的灵芝酸A（k）为内参物，按公式fk/m＝fk/fm＝Wk×Am/（Wm×Ak）[9]计算灵芝酸B、灵芝酸C2、灵芝酸D、灵芝酸F、灵芝酸H、灵芝烯酸A、灵芝烯酸B、灵芝烯酸C、灵芝烯酸D的相对校正因子，式中Ak为内参物峰面积，Wk为内参物质量或浓度，Am为待测成分的峰面积，Wm为待测成分的质量或浓度。结果显示，灵芝酸B、灵芝酸C2等灵芝酸类成分的相对校正因子平均值分别是1.788 5、1.288 2、1.126 4、1.698 5、0.885 4、5.468 1、4.210 9、5.780 8、4.290 3。2.5.2待测成分的色谱峰定位以灵芝酸A为基准峰，计算其他9种成分的相对保留时间，确定其在色谱图中的位置。结果显示，灵芝酸B、灵芝酸C2、灵芝酸D、灵芝酸F、灵芝酸H、灵芝烯酸A、灵芝烯酸B、灵芝烯酸C、灵芝烯酸D的相对保留时间平均值分别是0.429 2、0.476 3、0.674 8、0.740 2、0.867 6、1.067 6、1.373 5、1.504 5、1.844 6。2.5.3相对校正因子和相对保留时间的耐用性考察考察Series Ⅲ型、Waters 1525型2种HPLC仪及ZORBAX SB-C18、Alltima C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）2种色谱柱对相对校正因子和相对保留时间的影响。结果显示，灵芝酸B、灵芝酸C2、灵芝酸D、灵芝酸F、灵芝酸H、灵芝烯酸A、灵芝烯酸B、灵芝烯酸C、灵芝烯酸D相对校正因子的RSD分别为0.86%、0.47%、0.95%、1.13%、1.68%、0.98%、1.63%、1.07%、1.97%（n＝3），相对保留时间的RSD分别为1.90%、1.97%、1.55%、1.40%、1.34%、1.01%、1.38%、0.81%、0.84%（n＝3），表明不同仪器和色谱柱对相对校正因子和相对保留时间无明显影响。2.6样品测定按“2.3”项下方法制备不同产地灵芝供试品溶液（n＝3），按“2.1”项下色谱条件进样测定，分别采用QAMS法和ESM计算含量及相对误差（relative error，RE），结果见表3。两种方法所得结果无明显差异，说明QAMS法可用于评价灵芝的多种灵芝酸类成分含量。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.14.08.T003表3不同产地灵芝中10种灵芝酸类成分的含量（n＝3）编号灵芝酸A（ESM）/（mg/g）灵芝酸B灵芝酸C2灵芝酸D灵芝酸F灵芝酸H灵芝烯酸A灵芝烯酸B灵芝烯酸C灵芝烯酸DESM/（mg/g）QAMS/（mg/g）RE/%ESM/（mg/g）QAMS/（mg/g）RE/%ESM/（mg/g）QAMS/（mg/g）RE/%ESM/（mg/g）QAMS/（mg/g）RE/%ESM/（mg/g）QAMS/（mg/g）RE/%ESM/（mg/g）QAMS/（mg/g）RE/%ESM/（mg/g）QAMS/（mg/g）RE/%ESM/（mg/g）QAMS/（mg/g）RE/%ESM/（mg/g）QAMS/（mg/g）RE/%S11.5420.7470.7520.670.6660.663－0.451.2551.252－0.241.2581.252－0.481.1521.147－0.430.1230.12300.2280.223－2.190.0550.0585.450.1160.114－1.72S20.7420.3180.3231.570.3090.305－1.290.4720.468－0.850.5440.5450.180.4580.455－0.660.2350.230－2.130.2260.2280.880.1020.1052.940.1260.1260S32.069－－－1.6291.626－0.181.3451.340－0.371.0481.042－0.570.9210.916－0.540.2050.2091.950.2290.2310.870.1090.108－0.920.1380.134－2.90S41.3740.6580.655－0.460.7880.787－0.130.7020.695－1.000.3960.4021.520.7820.775－0.900.2520.248－1.590.4500.4520.440.1620.157－3.090.3100.3110.32S51.4270.7110.702－1.270.5220.516－1.151.1691.1740.430.9220.919－0.331.0761.0800.370.1870.183－2.140.2260.225－0.440.0930.085－8.600.1490.146－2.01S61.5200.7130.7190.840.5850.579－1.031.2521.2600.641.0351.033－0.191.1951.1970.170.1460.144－1.370.2090.20900.0680.0691.470.1450.140－3.45S71.7790.5080.493－2.950.4230.417－1.421.0041.0060.200.6180.610－1.290.3920.387－1.280.2720.270－0.740.2710.2782.580.0720.0799.720.3230.3250.62S81.5000.6010.6050.670.4880.482－1.230.8320.8400.960.6430.6450.310.5700.5740.700.1330.1340.750.3410.3430.590.0720.0776.940.1520.148－2.63S91.2450.5970.6031.010.5120.508－0.780.9850.977－0.810.9480.946－0.210.6920.687－0.72－－－0.2180.212－2.750.0840.079－5.950.1680.162－3.57S102.3440.8920.9011.010.8560.850－0.701.8061.8100.221.1921.189－0.250.8120.8140.250.1750.1781.710.2290.2310.870.0770.075－2.600.1320.126－4.55S111.488－－－0.4110.410－0.240.8810.875－0.681.3601.3610.070.9600.9610.100.1890.188－0.530.2680.2742.240.0810.0888.640.2580.2642.33S122.0591.0111.005－0.590.6070.598－1.481.0421.0460.381.4241.423－0.071.2721.270－0.160.2380.236－0.840.2790.2914.300.0960.091－5.210.2590.256－1.16S130.294－－－0.1390.134－3.600.1010.1075.940.2110.209－0.950.1720.1751.740.1210.119－1.650.2220.2272.250.0620.056－9.680.1520.144－5.26S141.2690.1770.1833.390.4950.490－1.011.1261.1300.361.3121.308－0.300.8510.8520.120.2290.2310.870.2850.277－2.810.1010.093－7.920.2910.282－3.09S151.2380.6040.599－0.830.4730.470－0.630.4790.4881.880.4560.45600.6010.592－1.500.5400.5420.370.5960.585－1.850.1750.166－5.140.5740.5872.26S160.4650.1610.1663.110.3220.3250.930.7910.7950.510.9170.912－0.550.6870.6910.580.1760.175－0.570.2640.259－1.890.0780.076－2.560.2430.234－3.70S171.7830.9820.973－0.920.9590.9640.520.7650.7700.650.5020.5040.400.6220.6270.800.3590.354－1.390.4220.418－0.950.1300.1321.540.4310.422－2.09S181.2970.7550.7570.260.9300.9310.110.5320.5381.130.4110.404－1.700.7350.7380.410.4320.429－0.690.7810.772－1.150.2590.2641.930.5010.496－1.00S191.3300.5490.544－0.910.4330.4360.690.6980.7030.720.5180.5210.580.9110.9140.330.4010.396－1.250.5400.5430.560.1280.126－1.560.4840.474－2.07S202.4310.8510.8530.240.5660.564－0.351.4821.4880.401.1981.2020.330.8270.8280.120.1550.154－0.650.2110.2141.420.0720.069－4.170.1220.121－0.82S210.7200.5330.5391.130.5010.5020.200.3900.3930.770.3450.342－0.870.3350.3360.300.2250.22500.3200.3210.310.0960.0993.130.2330.2361.29S220.964－－－0.4680.455－2.780.5580.5630.900.5560.5580.360.6660.665－0.150.1530.152－0.650.2360.230－2.540.1020.1030.980.1580.154－2.53S231.3111.0221.0230.100.4210.4250.951.0551.0560.090.7620.757－0.661.0551.051－0.380.1580.155－1.900.5720.569－0.520.0650.0661.540.1350.1392.96S241.303－－－0.3100.302－2.581.0721.0760.370.8480.8520.470.9000.9020.220.1480.1533.380.4420.439－0.680.0650.064－1.540.1420.1473.52S251.2490.5990.594－0.830.2670.2721.871.2921.289－0.230.4050.4080.740.6920.685－1.010.1420.14200.2920.285－2.400.0780.0836.410.1750.170－2.86S262.8631.0111.0150.400.9110.9150.441.4751.472－0.200.8700.8740.460.8720.868－0.460.1580.150－5.060.3330.329－1.200.0940.093－1.060.1590.158-0.63S271.4170.7130.7190.840.4960.5011.010.9910.985－0.610.7330.73300.9110.908－0.330.1530.151－1.310.3390.3410.590.0710.063－11.270.1210.118－2.48S281.3260.8190.8230.490.8010.799－0.250.8620.857－0.580.3390.330－2.650.5540.549－0.900.2690.2731.490.2380.236－0.840.1150.114－0.870.1560.152－2.56S292.1470.5500.5530.550.5150.5190.781.1481.1520.350.6410.6430.310.7330.7350.270.3720.3740.540.4320.427－1.160.0660.062－6.060.1820.176－3.30S302.8980.5390.534－0.930.5630.5691.072.0092.0150.301.0901.0930.280.7660.7670.130.1360.130－4.410.2980.3011.010.0680.0691.470.1070.1113.74－：未检出。3讨论灵芝酸类成分是灵芝主要的功效成分，但大多数灵芝酸类成分的对照品不易获得，限制了HPLC法在其检测中的应用。本文在前期研究的基础上，以灵芝中含量较高且稳定、对照品相对容易获得的灵芝酸A为内参物，通过优化色谱条件，建立了QAMS法。本研究分别考察了不同品牌HPLC仪和色谱柱对灵芝酸A与灵芝酸B、灵芝酸C2、灵芝酸D、灵芝酸F、灵芝酸H、灵芝烯酸A、灵芝烯酸B、灵芝烯酸C、灵芝烯酸D之间相对校正因子和相对保留时间的影响，结果表明各成分相对校正因子和相对保留时间重现性良好。对30批不同产地灵芝中10种灵芝酸类成分进行测定，结果表明，本文建立的QAMS法测定结果与ESM测定结果无明显差异，说明该QAMS法具有可行性，可用于灵芝的质量评价研究。