类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种常见的慢性系统性自身免疫疾病，以侵蚀性关节炎为主，严重时可导致关节损伤和不可逆的残疾。RA的全球患病率为0.5%～1%，以女性多见且有逐年上升的趋势，已严重影响患者的身心健康及生活质量[1]。临床治疗RA的药物有传统抗风湿药物、非甾体类药物及生物制剂等，虽能有效缓解临床症状，但存在毒副作用大或成本高的问题[2]。RA在中医理论中属“痹症”范畴，“痹”有闭塞不通之意，病因主要是人体正气不足从而使风、湿、寒、暑等外邪侵入[3]。大量研究表明，中医治疗RA具有疗效好、安全性高的优势，这提示中药治疗RA具有广阔前景。近年来，越来越多的研究表明植物甾醇不仅具有抗炎活性，还对先天性或获得性免疫系统具有调节作用[4―5]。植物甾醇种类繁多，其中β-谷甾醇是中药中含量高且分布广泛的一种。已有研究表明，β-谷甾醇具有与地塞米松相似的药代动力学特性[4]，可预防肥胖相关的慢性炎症[6]，还对前列腺增生引发的前列腺炎具有治疗作用[7]，这些研究均表明β-谷甾醇具有强大的抗炎活性；β-谷甾醇还可调节机体免疫系统活性，如选择性地抑制2型辅助性T细胞活性并促进其向1型辅助性T细胞转变，增加免疫活性物质[8]。以上的研究提示β-谷甾醇或可用于治疗RA，但β-谷甾醇对RA的具体作用还未可知。因此本文拟探索β-谷甾醇对人RA滑膜成纤维细胞MH7A功能的影响及其机制，为临床应用β-谷甾醇治疗RA提供理论支持。1材料1.1主要仪器本研究所用的主要仪器有LS-C0150型CO2培养箱（美国Thermo Fisher Scientific公司）、SW-CJ-1F型超净工作台（浙江苏净净化设备有限公司）、BX51型荧光显微镜（日本Olympus公司）、iMark型酶标仪（美国Bio-Rad公司）、MyGOPRO型定量实时聚合酶链式反应（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）仪（英国IT-IS公司）、JY300HC型电泳仪（北京君意东方电泳设备有限公司）。1.2主要药品与试剂β-谷甾醇标准品（批号SS8580，纯度≥98%）、CCK-8试剂盒（批号CA1210）、白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（批号SEKH-0002）和IL-6 ELISA试剂盒（批号SEKH-0013）均购自北京索莱宝科技有限公司；胎牛血清（批号2094466RP）、DMEM培养基（批号8122250）、Opti-MEM I培养基（批号31985070）均购自美国Gibco公司；Cell-LightTM EdU Apollo567 In Vitro Kit（批号C10310-1）购自广州市锐博生物技术有限公司；X-tremeGENE siRNA转染试剂（批号4476093001）购自瑞士Roche公司；逆转录试剂盒（批号D7168M）购自上海碧云天生物技术有限公司；小鼠过氧化物酶体增殖物激活受体α（peroxisome proliferator-activated receptor α，PPARα）单克隆抗体（批号MA1-822）、阴性对照小干扰RNA（negative control small interfering RNA，siNC）、PPARα小干扰RNA（PPARα small interfering RNA，siPPARα；靶序列为5′-CAATGTTTATAATCCTATAAG- 3′）均购自美国Thermo Fisher Scientific公司；小鼠β-actin抗体（批号ab179467）、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的羊抗鼠IgG抗体（批号ab205719）均购自英国Abacm公司。1.3细胞株人RA滑膜成纤维细胞MH7A购自北纳创联生物技术有限公司，货号为BNCC337864。2方法2.1网络药理学分析2.1.1β-谷甾醇治疗RA的靶点预测利用SwissTargetPrediction平台（http：//www.swiss- targetprediction.ch/）和TCMSP数据库（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）预测并收集β-谷甾醇的作用靶点；使用TTD（http：//db.idrblab.net/ttd/）、OMIM（https：//www.omim.org/）和pharmGKB（https：//www.pharmgkb.org/）数据库收集RA的相关靶点。利用VENNY2.1.0平台（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html），将β-谷甾醇作用靶点和RA相关靶点导入取交集，交集靶点即为β-谷甾醇治疗RA的潜在靶点。2.1.2靶点蛋白互作网络的拓扑分析利用String平台（https：//cn.string-db.org/）构建交集靶点蛋白的互作网络，以TSV格式导入Cytoscape软件，依据节点的度值、中心性进行网络拓扑分析。2.2β-谷甾醇对MH7A细胞功能的影响2.2.1细胞培养使用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养MH7A细胞，于37 ℃、5%CO2孵箱中培养，当细胞融合度达80%时进行传代培养。2.2.2MH7A细胞活力的检测采用CCK-8法进行检测。取对数生长期的MH7A细胞，以5×104个/mL的密度接种于96孔板中，每孔100 μL。待细胞贴壁后，分别加入10 μL不同浓度的β-谷甾醇[终浓度为0（空白组）、5、10、20、40 μmol/L，参照相关文献[9]实验方法进行调整]。24 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液孵育4 h，采用酶标仪于450 nm波长处测定每孔的吸光度值，计算细胞活力以筛选β-谷甾醇最适给药浓度。2.2.3MH7A细胞增殖能力的检测采用CCK-8法进行检测。取对数生长期的MH7A细胞，以2×104个/mL的密度接种于96孔板中，每孔100 μL培养过夜，弃去培养液。将细胞分为对照组（细胞不做任何处理）、模型组（10 ng/mL TNF-α诱导，剂量设置参考文献[10]）、β-谷甾醇组（10 ng/mL TNF-α+β-谷甾醇，β-谷甾醇的剂量设置参考“2.2.2”项下所得结果），同时设置空白组（不加细胞和药物，只加培养基），每组设3个复孔。对照组加入新鲜培养基，模型组和β-谷甾醇组先加入含10 ng/mL TNF-α的培养基孵育细胞12 h，β-谷甾醇组再加入β-谷甾醇进行处理。给药处理24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液孵育4 h，酶标仪测定每孔450 nm波长处的光密度值（optical density，OD）值，计算细胞活力。细胞活力（%）＝（实验组OD450－空白组OD450）/（对照组OD450－空白组OD450）×100%，实验组即模型组和β-谷甾醇组。采用5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷（EdU）法进行检测。取对数生长期的MH7A细胞，以2×104个/mL的密度接种于96孔板中，每孔100 μL培养过夜。细胞分为对照组、模型组、β-谷甾醇组，各组同CCK-8法相应组进行处理。24 h后每孔加入50 μmol/L的EdU溶液100 μL孵育2 h后弃培养基，PBS清洗2次。加入4%多聚甲醛50 μL于室温孵育30 min，再加入2 mg/mL的甘氨酸50 μL于摇床孵育5 min并清洗。加入100 μL 0.5%曲拉通X-100于摇床孵育10 min后废弃，加入Apollo染色液100 μL，避光、室温、摇床孵育30 min后，加入100 μL 0.5%曲拉通X-100清洗2～3次。最后加入100 μL Hoechst 33342染色液，避光、室温、摇床孵育30 min，PBS清洗后于荧光显微镜下观察并拍照，统计发生增殖的细胞数目。2.2.4MH7A细胞迁移能力的检测采用划痕实验进行检测。取对数生长期的MH7A细胞以2×105个/mL接种于6孔板，每孔2 mL。待细胞融合至80%及以上，用10 μL枪头垂直划线后用PBS清洗3次，加入2 mL无血清培养基，显微镜下拍照记录为0 h的划痕状态。按“2.2.3”项下EdU法分组、给药。24 h后在显微镜下拍照，使用Image J软件统计划痕面积并计算细胞迁移率。细胞迁移率（%）＝（0 h划痕面积－24 h划痕面积）/0 h划痕面积×100%。2.2.5MH7A细胞侵袭能力的检测采用Transwell侵袭法进行检测。Transwell上室预先涂基质胶备用，取对数生长期的MH7A细胞用无血清培养基调整密度为2×105个/mL并接种于上室中，每孔100 μL，下室加入600 μL完全培养基。按“2.2.3”项下EdU法分组、给药。24 h后，取出上室，去除培养基，用棉签轻轻擦拭基质胶和上室内未侵袭的细胞。取新的24孔板，加入600 μL 4%多聚甲醛，放入上室固定30 min，弃固定液，用0.1%结晶紫染色10 min，PBS清洗风干后置显微镜下观察计数。2.2.6MH7A细胞上清液中IL-1β、IL-6水平的检测采用ELISA法进行检测。取对数生长期的MH7A细胞以3×105个/mL接种于24孔板，每孔1 mL，待细胞贴壁后，按“2.2.3”项下EdU法分组、给药。24 h后，收集各组细胞的培养上清液，按相关试剂盒操作说明书进行操作，检测IL-1β、IL-6水平。2.2.7MH7A细胞中PPARα mRNA表达水平的检测采用qRT-PCR法进行检测。取对数生长期MH7A细胞以1×105个/mL接种于6孔板，每孔2 mL，待细胞贴壁后，按“2.2.3”项下EdU法分组、给药。24 h后收集细胞，采用Trizol法提取各组细胞总RNA，使用逆转录试剂盒合成cDNA后以其为模板进行RT-PCR。以β-actin为内参，用2－△△Ct法计算PPARα的相对表达量。PPARα上游引物为5′-GATGCGCTGACAGATGGAGA-3′，下游引物为5′-TAGAGACGGCTCTTCTGCCT-3′；β-actin上游引物为5′-GCCAACACAGTGCTGTCTGG-3′，下游引物为5′-CTCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3′。2.2.8MH7A细胞中PPARα蛋白表达水平的检测采用Western blot法进行检测。按“2.2.7”项下方法接种细胞，按“2.2.3”项下EdU法分组、给药。24 h后收集细胞，向细胞沉淀中加入RIPA裂解液（含1%蛋白酶抑制剂）在冰上裂解30 min，低温离心取上清液。用BCA试剂盒对各组蛋白进行定量分析，取等量蛋白质变性后行聚丙烯酰胺凝胶电泳并转移至PVDF膜，加5%脱脂奶粉于室温封闭1 h，随后加入不同一抗[PPARα（2 μg/mL）、β-actin（稀释比为1∶1 000）]于4 ℃孵育过夜，TBST清洗后加入HRP标记的羊抗鼠IgG（稀释比为1∶2 000）室温孵育1 h，洗涤后加入ECL发光液显影，用Image J软件分析灰度值。以β-actin作为内参，计算PPARα的相对表达量。2.3PPARα敲低后β-谷甾醇对MH7A细胞增殖、迁移、侵袭、炎症因子分泌及PPARα蛋白表达的影响取对数生长期MH7A细胞以5×104个/孔接种于24孔板中，当细胞汇合至40%时进行转染。将细胞分为β-谷甾醇组（细胞不转染，用10 ng/mL TNF-α+β-谷甾醇处理，剂量设置同“2.2.3”项下分组设置，下同）、siNC组（细胞转染siNC并用10 ng/mL TNF-α+β-谷甾醇处理）、siPPARα组（细胞转染PPARα siRNA并用10 ng/mL TNF-α+β-谷甾醇处理），每组设3个复孔。准备无菌离心管，加入47.5 μL无血清Opti-MEM I培养基和2.5 μL的X-tremeGENE siRNA转染试剂混合备用；再将40 μmol/L的siNC、siPPARα分别与50 μL无血清Opti-MEM I培养基混合，混匀上述两管液体后于室温孵育15 min，旋转滴加入各组对应的孔中，37 ℃孵育48 h后提取细胞总蛋白，按“2.2.8”项下方法进行Western blot检测，验证PPARα的敲低效率。取转染后的各组细胞，按“2.2.3”项下方法检测细胞增殖能力，按“2.2.4”项下方法检测细胞迁移能力，按“2.2.5”项下方法检测细胞侵袭能力，按“2.2.6”项下方法检测IL-1β和IL-6的水平。2.4统计学方法采用GraphPad Prism 8软件对数据进行统计学分析。实验数据以x±s表示。单因素方差分析组间差异，组间两两比较用Bonferroni法进行分析。检验水准α＝0.05。3结果3.1β-谷甾醇治疗RA的靶点预测结果通过不同数据库共筛选得到103个β-谷甾醇的作用靶点，得到385个RA的治疗靶点，两者取交集后得到15个β-谷甾醇治疗RA的潜在靶点。3.2靶点蛋白互作网络的拓扑分析结果利用String平台及Cytoscape软件，得到15个靶点对应蛋白的靶点蛋白互作网络拓扑分析图。结果如图1所示，其中圆形节点代表靶蛋白，节点越大、橙色越深，表示度值越高，在互作网络中作用越关键。该图表明PPARα是β-谷甾醇治疗RA的最关键靶点。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.15.11.F001图1靶点蛋白互作网络拓扑分析图3.3β-谷甾醇对MH7A细胞活力的影响与空白组相比，5、10 μmol/L的β-谷甾醇处理对MH7A的细胞活力无明显影响，β-谷甾醇浓度≥20 μmol/L时，细胞活力显著下降（P＜0.05）。细胞活力大于80%的药物浓度为无毒剂量，β-谷甾醇5、10 μmol/L组虽然满足细胞活力大于80%，但与空白组相比，细胞活力无显著差异，因此选择20 μmol/L作为后续实验浓度。结果见图2。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.15.11.F002图2β-谷甾醇对MH7A细胞活力的影响a：与空白组相比，P＜0.05。3.4β-谷甾醇对MH7A细胞增殖的影响与对照组相比，模型组细胞活力上升了120%（P＜0.05）；经β-谷甾醇处理后，细胞活力下降了80%（P＜0.05）。荧光图显示，与对照组相比，模型组发生增殖的细胞数目（38个）显著增加（P＜0.05）；经β-谷甾醇处理后，发生增殖的细胞数目（22个）显著减少（P＜0.05）。结果见图3。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.15.11.F003图3β-谷甾醇对MH7A细胞增殖的影响（×100）3.5β-谷甾醇对MH7A细胞迁移的影响与对照组相比，模型组细胞迁移率[（71.55±2.78）%]显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，β-谷甾醇组细胞迁移率[（58.73±0.84）%]显著降低（P＜0.05）。结果见图4。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.15.11.F004图4β-谷甾醇对MH7A细胞迁移的影响（×100）3.6β-谷甾醇对MH7A细胞侵袭的影响与对照组相比，模型组细胞侵袭数（220个）显著增加（P＜0.05）；与模型组相比，β-谷甾醇组细胞侵袭数（160个）显著减少（P＜0.05）。结果见图5。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.15.11.F005图5β-谷甾醇对MH7A细胞侵袭的影响（×100）3.7β-谷甾醇对MH7A细胞炎症因子释放的影响与对照组相比，模型组细胞的IL-1β水平[（39.65±0.93） pg/mL]、IL-6水平[（142.88±4.76） pg/mL]均显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，β-谷甾醇组细胞的IL-1β水平[（16.60±1.18） pg/mL]、IL-6水平[（64.95±4.95） pg/mL]均显著降低（P＜0.05）。3.8β-谷甾醇对MH7A细胞PPARα mRNA和蛋白表达水平的影响模型组PPARα mRNA表达水平对比对照组下降了64.3%（P＜0.05）；β-谷甾醇组PPARα mRNA的表达水平对比模型组增加了2.02倍（P＜0.05）。模型组PPARα蛋白表达水平对比对照组下降了86.3%（P＜0.05）；β-谷甾醇组PPARα蛋白表达水平对比模型组增加了4倍（P＜0.05）。PPARα蛋白表达的电泳图见图6。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.15.11.F006图6MH7A细胞中PPARα蛋白表达的电泳图3.9PPARα敲低后β-谷甾醇对MH7A细胞增殖、迁移、侵袭及炎症因子释放的影响与siNC组相比，siPPARα组细胞转染siPPARα后，PPARα蛋白表达量下降了82.2%（P＜0.05），表明PPARα被成功敲低。与siNC组相比，敲低PPARα后，细胞活力上升35.6%（P＜0.05），发生增殖的细胞数目增加至34个（P＜0.05）；与siNC组相比，敲低PPARα后，细胞迁移率从（52.09±1.70）%增加至（73.22±0.61）%（P＜0.05），细胞侵袭数由157个增加至189个（P＜0.05）；与siNC组相比，敲低PPARα后，细胞培养上清液中IL-1β的水平从（13.88±1.57） pg/mL升高至（33.07±1.89） pg/mL，IL-6的水平从（66.36±2.33） pg/mL升高至（111.50±5.47） pg/mL（P＜0.05）。结果见图7。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.15.11.F007图7PPARα敲低后β-谷甾醇对MH7A细胞的影响4讨论RA具有发病率高、致残率高的特点，严重影响患者的身体健康[11]。RA主要病因表现为关节成纤维滑膜细胞的过度增殖和侵蚀能力增加。因此，阐明RA滑膜成纤维细胞在RA中的特性，对RA治疗具有指导意义。文献表明，β-谷甾醇对慢性炎症疾病有治疗作用，如β-谷甾醇以抗病原菌为靶点改善小鼠实验性结肠炎[12]、β-谷甾醇通过调节树突状细胞抑制卵清蛋白诱导的哮喘炎症[13]等。除此之外，有报道分析称中药复方如穿龙汤、二妙散等对RA有治疗作用，而β-谷甾醇是这些复方中含量较高的药物活性成分[14―15]，以上内容均提示β-谷甾醇对RA可能有治疗作用。本文通过网络药理学分析手段，发现β-谷甾醇具有多个治疗RA的潜在靶点，其中PPARα是重要的靶点之一。为了验证β-谷甾醇对RA的具体作用及相关机制，本文通过体外实验进行了探索。RA的主要临床特征是滑膜关节的慢性炎症、血管翳的形成、进行性骨侵蚀和关节破坏[16]，因此针对RA滑膜成纤维细胞炎症、迁移、侵袭及血管生成的研究对于RA的治疗有重要意义。已有文献报道β-谷甾醇可通过调节巨噬细胞的极化减轻小鼠的类风湿性炎症[17]，还可以通过血管内皮生长因子信号通路抑制类风湿性滑膜的血管生成[18]。而本文从细胞增殖、迁移、侵袭和抗炎方面入手，阐述β-谷甾醇对RA的治疗作用。结果表明，β-谷甾醇可以抑制TNF-α诱导后MH7A细胞的增殖、迁移和侵袭，降低IL-1β和IL-6的水平，以此来抑制RA的病程发展，但相关机制还未可知。PPAR是一种核受体，属于类固醇激素受体超家族，目前已经鉴定出3种PPAR亚型：PPARα，PPARγ和PPARβ/δ，它们可调节参与细胞代谢及能量稳态、细胞分化和细胞内炎症基因的表达[19]。本研究网络药理学分析结果表明PPARα是β-谷甾醇治疗RA的重要靶点之一，研究结果也证实β-谷甾醇可以提高MH7A细胞PPARα转录水平及蛋白水平。β-谷甾醇属于甾体类化合物，其化学结构与类固醇相似，是类固醇激素的合成前体，在体内表现出一定的类激素活性[20]，这可能是β-谷甾醇调控PPARα表达的一种机制。此外，本文的研究结果还显示，敲低PPARα可以逆转β-谷甾醇对建模后MH7A细胞增殖、迁移及侵袭能力的抑制作用，炎症因子的表达水平也有所回升，表明PPARα可作为β-谷甾醇治疗RA的靶点之一。综上所述，β-谷甾醇可以抑制TNF-α诱导的MH7A细胞的增殖、迁移、侵袭和炎症因子分泌，其作用机制与激活PPARα通路有关。然而，β-谷甾醇的药理活性丰富，且关于RA的靶点较多，本研究仅从细胞水平和单靶点方向进行了探讨，这是本文的局限性和不足之处，更具体的作用机制还需深入探讨。