肾细胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是泌尿系统常见的恶性肿瘤，约25%的患者最初即被诊断为晚期或转移性RCC。即使有手术切除史的RCC患者，也有20%～40%会发生转移性RCC，而细胞因子治疗和分子靶向治疗的效果有限[1]。中药抗肿瘤作用及机制一直是研究热点。小檗碱（berberine，BER）是一种从黄连中分离出来的生物碱，是传统中药黄连的主要有效成分，可用于治疗许多疾病，如消化、代谢、心血管和神经系统疾病以及肿瘤[2]。有研究指出，在RCC中，BER可通过调控基质金属蛋白酶2（matrix metallopeptidase 2，MMP2）的表达发挥抗肿瘤作用[3]。最近的一项研究表明，在光动力疗法中BER可作为一种光敏剂抑制RCC发展[4]。目前国内外关于BER抑制肾癌细胞侵袭、迁移的机制研究鲜有报道，需要更多的研究证实。甲基转移酶样蛋白3（methyltransferase-like 3，METTL3）是N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine，m6A）修饰过程中的一个关键分子。研究显示，METTL3在多种实体瘤中常明显扩增，例如结肠癌[5]、前列腺癌[6]等，因此METTL3是一种原癌基因。在RCC中METTL3的表达明显高于正常组织，并且METTL3低表达患者的总生存期明显长于METTL3高表达患者[7]。可见，METTL3可能是BER抗RCC的一个重要靶点。鉴于此，本研究通过体外培养人肾癌OSRC-2细胞，探索BER对OSRC-2细胞增殖、周期、迁移和侵袭的影响，并探讨BER对METTL3表达的调控作用，分析其抗RCC的可能机制，为其后续研究提供理论支持。1材料1.1主要仪器本研究所用的主要仪器有A2型生物安全柜、MultiskanTMFC型酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）、Centrifuge 5418 R型高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）、PowerPacTMBasic型电泳仪、Chemidoc Tonch型化学发光显影仪（美国Bio-Rad公司）、CKX41-A32PH型倒置显微镜（日本Olympus公司）。1.2主要药品与试剂小檗碱对照品（批号8818，纯度≥98%）购自上海诗丹德生物技术有限公司；胎牛血清（FBS）、DMEM培养基、鼠抗人β-肌动蛋白（β-actin）单克隆抗体（批号分别为MFBS2206X、MSDM2207X、MAN1001）均购自上海迈基生物技术有限公司；m6A甲基化定量试剂盒（批号P-9008）购自美国Epigentek公司；胰蛋白酶、蛋白裂解液、BCA蛋白浓度定量试剂盒（批号分别为030723220323、101722221111、092822221104）均购自上海碧云天生物技术有限公司；超敏ECL化学发光试剂盒（批号2227601）购自美国Millipore公司；蛋白预染Marker（批号2590111）购自美国Thermo Fisher Scientific公司；兔抗人METTL3单克隆抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗鼠免疫球蛋白G（IgG）二抗、HRP标记羊抗兔IgG二抗（批号分别为15014、15015、67733-1-Ig）均购自美国Proteintech公司。1.3细胞株人肾癌OSRC-2细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。2方法2.1细胞培养OSRC-2细胞采用含10%FBS的DMEM培养基培养，培养箱条件设定为37 ℃、5%CO2，常规培养与传代。选取对数生长期的细胞进行后续实验。2.2BER对细胞增殖的影响采用alamarBlue法进行测定。取对数生长期的OSRC-2细胞，采用含10%FBS的DMEM培养基常规培养，调整细胞密度为3×103个/mL，按100 μL/孔接种到96孔板内。将细胞分为对照组（0 μmol/L）和不同浓度（25、50、75、100、125、150、175、200 μmol/L，浓度依据前期预实验结果设置）的BER组，每组设置6个复孔；另设空白对照组（不加细胞和药物，只加培养基）。分别干预24、48 h后，每孔加入10 μL alamarBlue试剂，在37 ℃下孵育2 h后用酶标仪测定各孔的光密度（optical density，OD）值，其激发光波长为560 nm、发射光波长为590 nm。计算细胞增殖抑制率：细胞增殖抑制率（%）＝[1－（实验组OD值－空白对照组OD值）/（对照组OD值－空白对照组OD值）]×100%。实验重复3次。2.3BER对细胞周期的影响采用流式细胞术进行检测。取对数生长期细胞，将细胞以2×105个/孔的密度接种于6孔板中，常规培养。待细胞稳定后分为对照组（0 μmol/L）和不同浓度（50、100 μmol/L，浓度根据“2.2”项下实验结果设置）BER组，每组设置3个复孔。BER干预48 h后，以1 000 r/min离心4 min，收集细胞。用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，加入500 μL预冷的70%乙醇，于4 ℃固定过夜。再次以1 000 r/min离心4 min去除乙醇，并用预冷的PBS洗涤细胞，加入500 μL含100 μg/mL RNase A的PBS，37 ℃水浴30 min，继续加入50 μg/mL碘化丙啶（PI），4 ℃避光30 min，以标准程序用流式细胞仪测定各组细胞的细胞周期占比。实验重复3次。2.4BER对细胞迁移能力的影响采用划痕实验进行检测。取对数生长期细胞，将细胞以4×105个/孔的密度接种到6孔板内，常规培养至细胞基本融合至90%。用200 μL无菌移液器枪头垂直于细胞上划出细痕，每孔3条。PBS缓慢洗2遍，去除划除的细胞。按“2.3”项下方法分组及给药，每组设置3个复孔，每孔加入含1%PBS的DMEM培养基，继续培养。各组细胞分别于给药0、24、36 h时在同一位置拍照，记录划痕宽度，并计算细胞迁移率。细胞迁移率（％）＝（给药0 h时划痕宽度－给药24 h或36 h时划痕宽度）/给药0 h时划痕宽度×100%。2.5BER对细胞侵袭能力的影响采用Transwell实验进行检测。按“2.3”项下方法进行细胞接种、分组（每组设置3个复孔）、给药及培养，常规消化离心细胞。提前将基质胶于4 ℃解冻，基质胶与无血清培养基以1∶8的体积比混合均匀后取100 µL加入小室，于孵育箱中放置2 h。用无血清培养基稀释制成密度为1×105个/mL的细胞悬液，将各组细胞悬液吸取200 μL滴加在预先铺好基质胶的细胞小室上，将小室置于24孔板中，小室外添加含10%PBS的DMEM培养基500 μL。各组细胞于37 ℃继续孵育24 h，采用4%多聚甲醛固定20 min，用棉签拭去小室内的细胞，充分晾干后用中性树胶封片，在显微镜下随机选取4个视野，观察并计数侵袭细胞数量，最后计算4个视野下的平均细胞侵袭数。2.6BER对细胞中METTL3蛋白表达的影响采用Western blot法进行检测。按“2.3”项下方法进行细胞接种、分组、给药及培养。收集细胞，加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min，以12 000 r/min离心5 min，取上清液，采用BCA法测定上清液中总蛋白浓度，根据实验需要的蛋白上样量（30～50 ng）计算目标蛋白的体积，与上样缓冲液按照合适的比例混匀，100 ℃水浴加热6 min进行蛋白变性。各组取5 µL变性蛋白样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，起始浓缩胶电压调至70 V，待样本基本平齐后电压转至130 V，待溴酚蓝抵达凝胶底部时终止电泳。将分离后的蛋白电转移（电流200 mA，2 h）至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，用封闭液（5%脱脂牛奶）封闭1 h，加入METTL3、β-actin抗体（稀释比例均为1∶1 000），4 ℃孵育过夜；次日用TBST清洗4次后加入羊抗兔/鼠IgG二抗（稀释比例均为1∶3 000），室温孵育1 h；TBST洗涤3次，使用ECL化学发光液对蛋白进行显色成像。用Image J 1.53t软件进行灰度值分析，以目的蛋白条带与内参蛋白（β-actin）条带灰度值的比值作为目的蛋白的相对表达量。实验重复3次。2.7BER对细胞内RNA的m6A水平的影响按“2.3”项下方法进行细胞接种、分组（每组设置3个复孔）、给药及培养。用预冷的PBS冲洗2遍，用Trizol法提取细胞中总RNA，按照试剂盒说明书方法操作检测各组细胞内RNA的m6A水平。2.8统计学方法采用SPSS 24.0软件进行数据的统计分析。计量资料以x±s表示，组间比较用单因素方差分析和LSD-t检验。采用GraphPad Prism 8.0作图工具作图。检验水准α＝0.05。3结果3.1BER对OSRC-2细胞增殖的影响结果与对照组比较，干预24、48 h后，不同浓度BER组细胞的增殖抑制率均显著升高（P＜0.01），并呈时间和浓度依赖性趋势。结果见图1。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.15.14.F001图1不同浓度BER干预24、48 h后对细胞增殖的影响（x±s，n＝6）Ⅰ：25 μmol/L BER组；Ⅱ：50 μmol/L BER组；Ⅲ：75 μmol/L BER组；Ⅳ：100 μmol/L BER组；Ⅴ：125 μmol/L BER组；Ⅵ：150 μmol/L BER组；Ⅶ：175 μmol/L BER组；Ⅷ：200 μmol/L BER组；a：与对照组比较，P＜0.01。3.2BER对OSRC-2细胞周期的影响结果与对照组比较，干预48 h后，50、100 μmol/L BER组G0/G1期细胞的比例均显著升高（P＜0.01），S期和G2/M期细胞的比例均显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。结果见图2、图3。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.15.14.F002图2各组细胞周期检测的流式细胞图10.6039/j.issn.1001-0408.2023.15.14.F003图3BER干预48 h后各组细胞的细胞周期占比测定结果（x±s，n＝3）Ⅰ：对照组；Ⅱ：50 μmol/L BER组；Ⅲ：100 μmol/L BER组；a：与对照组比较，P＜0.01；b：与对照组比较，P＜0.05。3.3BER对OSRC-2细胞迁移能力的影响结果与对照组比较，干预24、36 h后，50、100 μmol/L BER组细胞迁移率均显著降低（P＜0.05或P＜0.01），且呈浓度和时间依赖性趋势。结果见图4、图5。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.15.14.F004图4BER对细胞迁移能力影响的显微图10.6039/j.issn.1001-0408.2023.15.14.F005图5BER对细胞迁移能力影响的检测结果（x±s，n＝3）Ⅰ：对照组；Ⅱ：50 μmol/L BER组；Ⅲ：100 μmol/L BER组；a：与对照组比较，P＜0.05；b：与对照组比较，P＜0.01。3.4BER对OSRC-2细胞侵袭能力的影响结果与对照组（侵袭细胞数量为385个）比较，50、100 μmol/L BER组侵袭细胞数量（分别为312、232个）显著减少（P＜0.05或P＜0.01），且呈浓度依赖性趋势。结果见图6。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.15.14.F006图6BER对细胞侵袭能力影响的显微图（×200）3.5BER对细胞中METTL3蛋白表达的影响结果与对照组比较，50、100 μmol/L BER组细胞中METTL3蛋白的相对表达量均显著降低（P＜0.01），且呈浓度依赖性趋势。结果见图7、表1。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.15.14.F007图7BER对细胞中METTL3蛋白表达影响的电泳图Ⅰ：对照组；Ⅱ：50 μmol/L BER组；Ⅲ：100 μmol/L BER组。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.15.14.T001表1各组细胞中METTL3蛋白的相对表达量及m6A水平测定结果（x±s，n＝3）组别METTL3/β-actinm6A水平对照组1.00±0.001.00±0.0050 μmol/L BER组0.75±0.01a0.79±0.06a100 μmol/L BER组0.64±0.01a0.51±0.02aa：与对照组比较，P＜0.01。3.6BER对细胞中RNA m6A水平的影响结果与对照组比较，50、100 μmol/L BER组细胞中RNA的m6A水平均显著降低（P＜0.01），且呈浓度依赖性趋势。结果见表1。4讨论RCC是世界上常见的恶性肿瘤之一。早期或局限性RCC通常采用部分或根治性肾切除术，5年生存率为92.6%，但由于处于RCC早期的患者无明显症状，大约30%的RCC患者在确诊时多已为中晚期或者发生转移，直接影响临床RCC患者的治疗和预后[8]。目前酪氨酸激酶抑制剂联合免疫检查点抑制剂可作为转移性RCC的一线治疗方式，并且可以有效改善患者预后[9]，但是从长期来看，RCC患者的5年生存率仍没有得到显著改善，原因是肿瘤产生了耐药性而继续发展[10]。因此，积极寻找RCC的预后标志物和治疗靶点，具有重要的临床意义。BER是一种从黄连等中草药中分离得到的异喹啉类衍生物的生物碱，目前已被广泛用于治疗糖尿病、代谢综合征、腹泻等多种临床疾病[2]。研究表明，BER具有抗肿瘤作用，比如肝癌、结肠癌、胃癌等[11―13]，涉及多种生物机制。另有研究发现，BER联合光动力治疗可以诱导肾癌细胞自噬及凋亡[3]。该结果提示，BER可以抑制RCC的进展。在本研究中，笔者通过alamarBlue实验、划痕实验及Transwell实验等进一步验证BER对肾癌细胞的作用。结果显示，BER可将肾癌细胞阻滞于G0/G1期，抑制其增殖、侵袭和迁移，这提示BER有望成为治疗RCC的新药物。m6A作为真核生物中最丰富的RNA转录后修饰形式，成为近期研究的热点。m6A可以通过调控靶RNA的翻译、加工、剪接、稳定和降解，在多种生物过程中发挥重要作用[14]。越来越多的证据表明，m6A调控因子与恶性肿瘤的发展密切相关，参与肿瘤的增殖、分化、发生等过程[15]。研究已证实，m6A在胃癌、膀胱癌和肝细胞癌等癌症的发生和发展中起致瘤作用，随着m6A在肿瘤过程中的作用得到越来越多的关注，m6A在卵巢癌、结直肠癌、乳腺癌等中的研究也越来越多[16]。而METTL3作为m6A甲基转移酶在肿瘤中也发挥着关键作用。例如，在膀胱癌中，METTL3通过催化转录调节因子AFF4和核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB） mRNA的m6A修饰，继而提高肿瘤的增殖以及侵袭能力[17]。有文献报道，METTL3的mRNA表达水平与患者的预后相关，且METTL3的mRNA低表达的患者生存率更高[18]。有研究指出，在RCC中METTL3低表达患者的总生存期明显长于METTL3高表达患者[7]。该结果提示，METTL3在RCC中发挥癌基因的功能，可促进肿瘤的发生和发展。本研究对BER干预后OSRC-2细胞的METTL3水平进行检测，Western blot的结果显示，BER可以明显降低肾癌细胞METTL3的蛋白表达水平，且呈浓度依赖性趋势。进一步研究发现，BER可以显著抑制OSRC-2细胞内RNA的m6A水平，且同样呈浓度依赖性趋势。这提示BER是通过下调METTL3的表达，继而抑制RNA m6A修饰发挥抗癌作用的。综上所述，BER能够阻滞肾癌细胞周期进程，显著抑制肾癌细胞的增殖、侵袭和迁移，其机制与下调METTL3的表达，进而抑制RNA的m6A水平有关。本研究的局限为仅在体外研究了该药抗RCC的活性，尚未在体内验证其活性，后续将进一步进行体内实验验证，从而为其应用于临床提供更多理论依据。