麻杏咳喘方是河北省中医院治疗“风温肺热病”“哮病”等疾病的经验方，临床使用近20年，疗效确切。该方由蜜麻黄、炒苦杏仁、蝉蜕、地龙、陈皮、防风、矮地茶、桑白皮、清半夏、厚朴、穿山龙、僵蚕、甘草组成，具有疏风宣肺、止咳平喘之效，主要用于治疗风邪犯肺、肺气失宣所致的咳嗽、咽痒、干咳无痰或少痰等。方中蜜麻黄宣肺平喘，炒苦杏仁润肺止咳，二者共为君药；蝉蜕疏散风热，地龙清热息风平喘，二者均为臣药；陈皮、厚朴理气止咳化痰，防风祛风解表，矮地茶化痰止咳，清半夏、桑白皮清肺化痰，穿山龙止咳平喘，僵蚕祛痰止咳，同为佐药；甘草调和诸药为使药。该方为传统中药汤剂，需临用前进行煎煮，质量不易控制，且煎液体积较大、服用不便、不利贮存，故本研究团队拟将其开发为颗粒剂，以便临床使用。Box-Behnken响应面法是对实验条件多个因素及水平进行分析的优选方法，具有实验次数少、结果准确度高等特点[1]；层次分析（analytic hierarchy process，AHP）-熵权法是对各指标进行赋权的方法，兼具AHP法、熵权法的优点，使所得结果更加真实可靠[2]。本研究以浸泡时间、加水量、总提取时间为考察因素，以蜜麻黄的有效成分盐酸麻黄碱[3]、矮地茶的有效成分岩白菜素[4]、防风的有效成分升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷[5]、陈皮的有效成分柚皮苷和橙皮苷[6―7]的含量以及出膏率为考察指标，采用AHP-熵权法对上述7种指标进行赋权，通过Box-Behnken响应面法筛选出麻杏咳喘颗粒的最佳水提工艺，以期为麻杏咳喘颗粒的开发及应用提供参考。1材料1.1主要仪器LC-20A型高效液相色谱仪购自日本Shimadzu公司（包括LC-20AT泵、SIL-20A自动进样器、SPD-M20A紫外检测器、CTO-20A柱温箱）；SQP型十万分之一电子天平购自赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；TG328B型万分之一分析天平购自上海精密科学仪器有限公司；TGL-16B型离心机购自上海安亭科学仪器厂；RE-52型旋转薄膜蒸发器购自上海亚荣生化仪器厂；SAS67120型超纯水系统购自美国Millipore公司；BGG-9240A型鼓风干燥箱购自上海一恒科学仪器有限公司。1.2药品与试剂蜜麻黄（产地内蒙古，批号211201）、炒苦杏仁（产地河北，批号220501）、蝉蜕（产地河北，批号220502）、陈皮（产地浙江，批号21103001）、防风（产地内蒙古，批号220501）、桑白皮（产地四川，批号220201）、清半夏（产地河北，批号D211201）、厚朴（产地四川，批号220501）、穿山龙（产地河北，批号220301）、僵蚕（产地四川，批号220501）、甘草（产地内蒙古，批号220301）均购于河北药兴药业有限公司，地龙（产地广东，批号21103001）、矮地茶（产地河北，批号18032601）购于国药乐仁堂河北药业有限公司，以上饮片经检查均符合2020年版《中国药典》（一部）项下相关规定。盐酸麻黄碱（批号171241-201809，纯度100.0%）、岩白菜素（批号111532-202005，纯度94.4%）、升麻素苷（批号111522-202214，纯度95.7%）、5-O-甲基维斯阿米醇苷（批号111523-202212，纯度97.8%）、柚皮苷（批号110722-202116，纯度93.5%）、橙皮苷（批号110721-202220，纯度97.2%）对照品均购于中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈为色谱纯，磷酸为分析纯。2方法与结果2.1指标成分的含量测定2.1.1色谱条件色谱柱为Venusil MP C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～12 min，10%A→16%A；12～44 min，16%A→24%A；44～55 min，24%A→35%A；55～60 min，35%A→90%A）；柱温为30 ℃；检测波长分别为210 nm（盐酸麻黄碱、岩白菜素、升麻素苷、柚皮苷）、283 nm（5-O-甲基维斯阿米醇苷、橙皮苷）；流速为1.0 mL/min；进样量为10 μL。2.1.2供试品溶液和阴性样品溶液的制备按处方比例称取各味饮片共59.5 g，加10倍量（mL/g）水浸泡30 min，煎煮2 h；过滤煎液，离心，取上清液减压浓缩至119 mL，得浓缩液。取2 mL浓缩液置于10 mL容量瓶中，以甲醇定容，摇匀，取上清液过0.22 µm微孔滤膜，即得供试品溶液。同法制得分别缺蜜麻黄、矮地茶、防风、陈皮的阴性样品溶液。2.1.3混合对照品溶液的制备精密称定盐酸麻黄碱、岩白菜素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、柚皮苷、橙皮苷对照品适量，分别置于10 mL容量瓶中，以甲醇溶解后定容，制得上述成分质量浓度分别为1.870 0、0.726 0、0.590 0、1.020 0、0.232 0、2.140 0 mg/mL的单一对照品母液。吸取各对照品母液1 mL，置于同一10 mL容量瓶中，以甲醇定容，即得混合对照品溶液。2.1.4方法学考察（1）专属性考察：取上述供试品溶液、各阴性样品溶液、混合对照品溶液、甲醇溶液（空白）适量，按上述色谱条件进样，记录色谱图。结果显示，甲醇溶液无干扰，混合对照品溶液和供试品溶液中各指标成分的分离度均大于1.5，专属性良好。结果见图1。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.17.09.F001图1专属性考察结果的色谱图a：甲醇溶液；b：混合对照品溶液（210 nm波长处）；c：供试品溶液（210 nm波长处）；d：混合对照品溶液（283 nm波长处）；e：供试品溶液（283 nm波长处）；f：缺蜜麻黄阴性样品溶液（210 nm波长处）；g：缺矮地茶阴性样品溶液（210 nm波长处）；h：缺防风阴性样品溶液（210 nm波长处）；i：缺防风阴性样品溶液（283 nm波长处）；j：缺陈皮阴性样品溶液（210 nm波长处）；k：缺陈皮阴性样品溶液（283 nm波长处）；1：盐酸麻黄碱；2：岩白菜素；3：升麻素苷；4：柚皮苷；5：5-O-甲基维斯阿米醇苷；6：橙皮苷。（2）线性关系考察：取“2.1.3”项下混合对照品溶液，加甲醇逐级稀释，得各成分不同质量浓度的对照品溶液，按上述色谱条件进样分析，以质量浓度为横坐标（x）、以峰面积为纵坐标（y）进行线性回归。结果见表1。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.17.09.T001表1各指标成分的线性关系考察结果指标成分回归方程R2线性范围/（μg/mL）盐酸麻黄碱y＝18 254x+49 9710.999 23.74～187岩白菜素y＝38 652x+32 0340.999 91.452～242升麻素苷y＝26 816x+20 4870.999 81.18～1185-O-甲基维斯阿米醇苷y＝12 673x+19 9240.999 72.04～204柚皮苷y＝26 158x+20 6640.999 10.464～46.4橙皮苷y＝13 671x+50 3510.999 84.28～428（3）精密度试验：取“2.1.3”项下混合对照品溶液，按上述色谱条件连续进样6次，记录峰面积，得盐酸麻黄碱、岩白菜素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、柚皮苷、橙皮苷峰面积的RSD分别为2.06%、2.42%、2.70%、1.56%、1.95%、0.69%（n＝6），表明仪器精密度良好。（4）重复性试验：按“2.1.2”项下制备方法，平行制备供试品溶液6份，按上述色谱条件进样，记录峰面积，根据外标法计算各成分含量，得盐酸麻黄碱、岩白菜素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、柚皮苷、橙皮苷含量的RSD分别为1.73%、2.28%、1.82%、1.56%、0.62%、2.61%（n＝6），表明该方法重复性良好。（5）稳定性试验：取同一供试品溶液，于室温放置0、4、8、12、16、24 h时，分别按上述色谱条件进样，记录峰面积，得盐酸麻黄碱、岩白菜素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、柚皮苷、橙皮苷峰面积的RSD分别为1.04%、2.01%、2.76%、1.89%、1.42%、1.47%（n＝6），表明供试品溶液在室温放置24 h内稳定。（6）加样回收率试验：取已知各成分含量的浓缩液1 mL，共6份，精密加入与各成分含量成1∶1（m/m）比例的盐酸麻黄碱、岩白菜素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、柚皮苷、橙皮苷对照品各适量，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，再按上述色谱条件进样测定，并计算加样回收率。结果显示，盐酸麻黄碱、岩白菜素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、柚皮苷、橙皮苷的平均加样回收率分别为101.54%、100.73%、101.80%、97.47%、98.86%、101.67%，RSD分别为2.46%、2.38%、1.62%、1.52%、1.25%、2.39%（n＝6），表明该方法准确度良好。2.2出膏率的测定精密量取浓缩液适量，置于干燥、恒重的蒸发皿中，采用烘箱于105 ℃下干燥至恒重；取出，放入干燥器中冷却30 min，称重，采用减重法计算出膏率[8]。2.3综合评分相关指标的权重确定2.3.1AHP法主观赋权采用AHP法对设定的各项指标进行主观赋权[2]，根据麻杏咳喘颗粒处方中各味药的君臣佐使关系及用量，对各指标进行层次划分，顺序为盐酸麻黄碱＝岩白菜素＞橙皮苷＝柚皮苷＞升麻素苷＝5-O-甲基维斯阿米醇苷＞出膏率，由此构建优先判断矩阵，见表2。计算得盐酸麻黄碱、岩白菜素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、柚皮苷、橙皮苷、出膏率的主观权重系数W1分别为0.250 8、0.250 8、0.084 6、0.084 6、0.145 5、0.145 5、0.038 1，一致性比率为0.009 1（＜0.10），表明所计算的指标权重系数可靠、有效。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.17.09.T002表2各指标的优先判断矩阵权重指标盐酸麻黄碱岩白菜素橙皮苷柚皮苷升麻素苷5-O-甲基维斯阿米醇苷出膏率盐酸麻黄碱1122335岩白菜素1122335橙皮苷1/21/211224柚皮苷1/21/211224升麻素苷1/31/31/21/21135-O-甲基维斯阿米醇苷1/31/31/21/2113出膏率1/51/51/41/41/31/312.3.2熵权法客观赋权采用熵权法对设定的各项指标进行客观赋权[2]，运用极值法无量纲化处理所得数据，以熵值法确定各指标权重系数（W2）。原始数据矩阵为X＝（Xij）mn，其中Xij为正指标，使用公式Yij=Xij-minXijmaxXij-minXij对已知数据进行处理，得标准化数据，所得数据均向右平移0.000 01个单位以消除0的影响。采用公式Hj=-1lnm∑i=1mPijlnPij计算各指标熵值（0≤Hj≤1，Pij=Yij/∑Yij为概率矩阵）。采用公式W2=1-Hj∑j=1n(1-Hj)计算各指标客观权重系数。2.3.3综合权重系数确定及综合评分计算将AHP法、熵权法确定的各指标权重系数W1、W2相结合，计算综合权重系数（W综合）：W综合=W1jW2j∑j=1nW1jW2j[2]。将各指标的W综合代入公式，计算综合评分，综合评分＝100×（盐酸麻黄碱含量/盐酸麻黄碱含量最大值×盐酸麻黄碱的W综合+岩白菜素含量/岩白菜素含量最大值×岩白菜素的W综合+升麻素苷含量/升麻素苷含量最大值×升麻素苷的W综合+5-O-甲基维斯阿米醇苷含量/5-O-甲基维斯阿米醇苷含量最大值×5-O-甲基维斯阿米醇苷的W综合+柚皮苷含量/柚皮苷含量最大值×柚皮苷的W综合+橙皮苷含量/橙皮苷含量最大值×橙皮苷的W综合+出膏率/出膏率最大值×出膏率的W综合）。2.4麻杏咳喘颗粒水提工艺参数的单因素实验本研究考察了浸泡时间、加水量、总提取时间、提取次数4个因素对提取效果的影响[8]。按“2.3”项下方法计算盐酸麻黄碱、岩白菜素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、柚皮苷、橙皮苷和出膏率的综合权重，发现当考察因素为浸泡时间时，各指标的W综合分别为0.205 4、0.233 5、0.073 0、0.101 4、0.208 0、0.146 4、0.032 2；考察因素为加水量时，各指标的W综合分别为0.235 5、0.258 6、0.079 5、0.094 8、0.118 7、0.179 0、0.033 9；考察因素为总提取时间时，各指标的W综合分别为0.198 7、0.200 6、0.077 1、0.096 9、0.240 1、0.149 5、0.037 1；考察因素为提取次数时，各指标的W综合分别为0.246 1、0.269 0、0.070 7、0.086 0、0.140 1、0.145 5、0.042 7。以7项指标的综合评分作为指标，在固定其他3个条件不变的前提下，分别对浸泡时间（0、30、60、90 min）、加水量（6、7、8、9、10倍）、总提取时间（90、150、210、270、330 min）、提取次数（1、2、3次）进行单因素考察，各平行3次。结果见图2。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.17.09.F002图2麻杏咳喘颗粒提取工艺参数的单因素考察结果由图2可知，图2A的曲线呈上升-平稳趋势，图2B、图2C的曲线均呈上升-下降趋势；由于提取次数为不连续因素，故不作为Box-Behnken响应面实验的考察因素。另外，图2D中曲线呈上升趋势，提取次数为2、3次时的综合评分分别为88.95、90.82分，数值差距小，且差异无统计学意义（P＝0.450），故固定提取次数为2次。因此，根据实验数据及生产实际，选取浸泡时间30 min、加水量8倍、总提取时间150 min作为Box-Behnken响应面实验优化的中心点。2.5Box-Behnken响应面法优化麻杏咳喘颗粒的水提工艺2.5.1Box-Behnken响应面实验设计参照单因素实验结果，应用Design-Expert V8.0.6.1软件进行Box-Behnken响应面实验设计[1]，固定提取次数为2次，以综合评分为响应值，考察浸泡时间（A）、加水量（B）、总提取时间（C）对水提工艺的影响。具体因素与水平见表3。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.17.09.T003表3因素与水平表水平A/minB/倍C/min－10790（60+30）0308150（90+60）1609210（120+90）2.5.2Box-Behnken响应面实验方案及结果按“2.3.2”项下方法计算得盐酸麻黄碱、岩白菜素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、柚皮苷、橙皮苷含量和出膏率的熵值分别为0.889 1、0.911 9、0.921 9、0.908 0、0.913 8、0.909 6、0.917 0；客观权重系数W2分别为0.176 4、0.140 2、0.124 3、0.146 3、0.137 1、0.143 8、0.132 0。AHP法所得主观权重系数W1不变，以AHP-熵权法综合赋权计算得盐酸麻黄碱、岩白菜素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、柚皮苷、橙皮苷含量和出膏率的W综合分别为0.298 5、0.237 2、0.071 0、0.083 6、0.134 6、0.141 2、0.033 9。按“2.3.3”项下公式计算不同Box-Behnken响应面实验方案所得综合评分，结果见表4。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.17.09.T004表4Box-Behnken响应面实验方案及结果编号A/minB/倍C/min指标成分含量/（mg/g）出膏率/%综合评分/分盐酸麻黄碱岩白菜素升麻素苷5-O-甲基维斯阿米醇苷柚皮苷橙皮苷13081501.210.550.610.850.252.3820.1892.502309901.080.510.550.740.232.0918.0683.4536082101.180.530.630.840.272.0819.1890.444071501.090.500.480.570.191.8618.2378.0853081501.240.570.541.080.212.8421.2495.5266071501.070.480.470.580.181.8919.3176.567091501.120.520.570.840.192.2318.9284.6586091501.180.500.590.880.262.4321.1290.619608901.130.490.550.730.221.9819.4782.91103092101.200.510.531.020.202.4121.5388.91113081501.210.540.650.890.222.4520.0091.65123081501.250.560.560.930.252.4319.7194.121308901.060.490.510.650.192.0617.9478.8414082101.070.550.510.670.232.2219.4184.76153072101.140.550.550.940.212.2920.5388.48163081501.220.550.540.860.232.4219.4791.1417307901.080.490.490.590.201.9418.8278.682.5.3Box-Behnken响应面实验结果分析采用Design-Expert V8.0.6.1软件多元拟合分析17组实验所得综合评分，得多元二次回归方程：综合评分＝92.99+1.77A+3.23B+3.59C+1.87AB+0.4AC－1.09BC－5.58A2－4.93B2－3.17C2。方差分析结果见表5。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.17.09.T005表5Box-Behnken响应面实验的方差分析结果差异来源平方和自由度均方FP显著性模型536.96959.668.930.004 3显著A25.17125.173.770.093 5B83.33183.3312.470.009 6C103.031103.0315.410.005 7AB13.99113.992.090.191 3AC0.6510.650.0970.764 6BC4.7114.710.700.429 0A2130.951130.9519.590.003 1B2102.511102.5115.340.005 8C242.36142.366.340.040 0残差46.7976.68失拟项33.66311.223.420.133 1不显著纯误差13.1443.28总差异583.7516由表5可知，拟合模型的P值为0.004 3（＜0.01），表明模型显著；失拟项的P值为0.133 1（＞0.05），表明失拟不显著，提示其他未明原因对实验结果影响较小，模型可靠。R2、Radj2分别为0.919 8、0.816 8，表明81.68%的响应值变化可被模型解释；r为0.919 8，表明所选变量可造成91.98%的响应值变化。变异系数为2.99%（＜10%），表明实验重复性、模型拟合度均良好。由此可知，该模型可用于分析并预测麻杏咳喘颗粒的水提工艺。一次项A为不显著影响，B、C为显著影响，3个因素对综合评分的影响程度依次为C＞B＞A，即总提取时间＞加水量＞浸泡时间；交互项的影响均不显著；二次项A2、B2、C2均为显著影响。经软件处理数据后，得到反映因素间交互强弱的等高线图和响应面图，具体见图3。等高线图中闭合曲线形状越趋向于正圆形时交互作用越弱，闭合曲线越趋向于椭圆形时交互作用越强；响应面图中曲面越陡、坡度越大，则因素间交互作用对综合评分的影响越大。由图3A可知，闭合曲线为更接近于圆形的椭圆形，曲面坡度变化较小，表明综合评分变化不明显，AB交互作用不显著；由图3B可知，椭圆形闭合曲线更接近于圆形，曲面坡度变化小，表明综合评分变化不明显，AC交互作用不显著；由图3C可知，闭合曲线接近于圆形，曲面坡度变化较小，表明综合评分变化不明显，BC交互作用不显著。将响应面图中的曲面坡度变化进行比较后发现，图3A中B曲面比A曲面坡度变化大，图3B中C曲面较陡峭，图3C中C曲面较B曲面更陡峭，由此可知，3个因素对综合评分的影响程度与方差分析结果相同。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.17.09.F003图3各因素对麻杏咳喘颗粒水提工艺综合评分的影响进一步利用软件预测麻杏咳喘颗粒的最佳水提工艺参数为：浸泡时间36.93 min，加水量8.31倍，总提取时间181.65 min。结合实际生产操作的可行性，将参数调整为：浸泡时间40 min，加水量8倍，总提取时间180 min（即第1次提取120 min，第2次提取60 min）。2.5.4工艺验证按比例称取处方饮片119 g，平行3份，按上述最佳预测工艺进行验证实验，得综合评分为94.82分（RSD＝0.96%，n＝3），与预测值94.64分差异较小，表明预测、优化后所得工艺均稳定可行。3讨论笔者在前期预实验中通过高效液相色谱法检测出了苦杏仁苷、甘草苷，但两者分离度较低，经更换流动相、调整流动相比例后，仍未能提高其分离度，故本研究不将其列为指标成分。笔者参考2020年版《中国药典》对各单味药材进行含量测定时，考察了以甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-水、乙腈-0.05%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液作为流动相时对实验结果的影响，结果发现，当流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液时，色谱峰分离度良好、基线平稳。采用DAD检测器在190～800 nm波长范围内对供试品溶液进行全波长扫描后发现，盐酸麻黄碱、岩白菜素、升麻素苷、柚皮苷在210 nm波长处的紫外吸收较强，5-O-甲基维斯阿米醇苷、橙皮苷在283 nm波长处的紫外吸收较强，故本研究选择双波长对供试品进行测定。本研究选用主、客观赋权相结合的AHP-熵权法确定各指标权重，相比于仅用AHP法或熵权法赋权更加科学合理。AHP法由研究者赋权各指标，能考虑到组方药材间关系、用量、疗效，但忽视了实际实验数据，主观性强[9]；熵权法根据实际得到的数据赋权各指标，消除了主观影响，却忽略了各指标间的主次轻重[10]。因此，AHP-熵权法能兼具二者的优点，使结果更合理可靠。本研究以AHP-熵权法赋权计算盐酸麻黄碱、岩白菜素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、柚皮苷、橙皮苷含量和出膏率的综合评分，采用Box-Behnken响应面法对麻杏咳喘颗粒的水提工艺进行优化，方法科学可靠，筛选出麻杏咳喘颗粒的最佳水提工艺为浸泡时间40 min，加水量8倍，总提取时间180 min。经验证，该方法可行，可为麻杏咳喘颗粒的进一步开发提供参考。