芸香科黄檗属植物在全球约有4种，主产于亚洲东部，在我国有2个种及1个变种：黄檗Phellodendron amurense Rupr.、川黄檗P. chinense Schneid.及变种秃叶黄檗P. chinense var. glabriusculum Schneid.。《中国药典》自2005年版起，将川黄柏与关黄柏列为2种药材，以“川黄柏”作“黄柏”，关黄柏单列[1]。黄檗为中药关黄柏的基原植物，主要分布在黑龙江、河北、山西、内蒙古、陕西等地[2]。川黄檗为中药黄柏的基原植物，因被过度开采使用导致其野生资源急剧减少。调查发现，至20世纪末，野生的川黄檗植物基本消失殆尽，而今中药黄柏的主流商品来源实则为变种秃叶黄檗，主要分布在四川、重庆、贵州、湖北、湖南和云南等地[3]。秃叶黄檗的树皮作为黄柏药材使用，具有清热燥湿、泻火除蒸、解毒疗疮的功效，主要用于治疗湿热泻痢、热淋涩痛、骨蒸劳热、盗汗、遗精、疮疡肿毒等病症[4]。据文献报道，黄檗属植物除树皮可作药用之外，其果实也可入药[5―6]。李焕荣等[7]研究发现，黄檗的果实中含有挥发油类、酚酸类、生物碱类和三萜类成分，其水煎液和挥发油均有祛痰止咳作用，民间多用于治疗慢性支气管炎[5―6]。另有研究发现，秃叶黄檗果实的主要成分包括挥发油类、生物碱类和三萜类化合物[8]，但其作药用还未见报道。本研究拟通过氨水引咳和药物祛痰小鼠模型实验研究秃叶黄檗果实的祛痰止咳作用；利用气相色谱-质谱联用（GC-MS）和超高效液相色谱-质谱（UPLC-MS）联用技术对秃叶黄檗果实的挥发油和非挥发性部位进行成分分析；并在药效研究和成分分析鉴定的基础上，通过网络药理学进一步探索秃叶黄檗果实祛痰止咳的物质基础及作用机制，为秃叶黄檗果实资源的综合利用研究提供依据。1材料1.1主要仪器本研究所用主要仪器包括7890A-5975C系列GC-MS联用仪（美国Agilent公司）、Vanquish型超高效液相色谱联用Q-Exactive四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）、SQP型十万分之一天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]、SpectraMax i3x型酶标仪[美谷分子仪器（上海）有限公司]等。1.2主要药品与试剂药材样品采自四川省雅安市荥经县，经成都中医药大学药学院龙飞副教授鉴定为芸香科黄檗属植物秃叶黄檗P.chinense var. glabriusculum Schneid.的成熟果实，低温干燥后密封储存。甜菜碱、小檗碱、小檗红碱、绿原酸、木犀草素对照品（批号分别为CYR-T0049200815、CYR- X0024210628、CYR-X004021022、CYR-L0098200419、CYR-M0072200308）均购自四川萃益润生物科技有限公司，熊果苷、柠檬苦素、红景天苷、山柰酚、延胡索乙素、秦皮甲素、巴马汀、黄柏酮、黄柏碱、吴茱萸碱对照品（批号分别为PS020727、PS010363、PS011476、PS011676、PS000988、PS012121、PS020011、PS010197、PS000447、PS012147）均购自成都普思生物科技股份有限公司，葫芦巴碱对照品（批号RDD-H05711801010）购自成都瑞芬思德丹生物科技有限公司，盐酸药根碱对照品（批号20081905）购自成都普菲德生物技术有限公司，槲皮素对照品（批号CHB190110）购自成都克洛玛生物科技有限公司，所有对照品的纯度均≥98%。氢溴酸右美沙芬片（批号51-221211，规格15 mg）购自北京天衡药物研究院南阳天衡制药厂；氯化铵（分析纯）购自成都市科隆化学品有限公司。乙腈、甲醇、甲酸均为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。1.3动物本研究所用动物为SPF级健康KM小鼠，共70只，雌雄各半，体重18～22 g，购自北京SPF生物科技有限公司，动物生产许可证号为SCXK（京）2019-0010。将小鼠饲养于成都中医药大学中医药管理局中药药理三级科研实验室。适应性饲养1周后用于实验。本实验方案经成都中医药大学实验动物伦理委员会批准，伦理批号为2021-80。2方法与结果2.1试药的制备2.1.1秃叶黄檗果实水煎液试药称取秃叶黄檗果实粉末（过三号筛）200 g，用10倍体积的水回流煎煮2 h，用纱布过滤后滤渣再用6倍体积的超纯水回流煎煮2 h，合并2次煎液，减压浓缩定容至100 mL，得生药量为2 g/mL的秃叶黄檗果实浸膏，临用时用生理盐水稀释至给药浓度。2.1.2秃叶黄檗果实挥发油试药称取秃叶黄檗果实粉末（过三号筛）100 g，加入10倍体积的水，采用水蒸气蒸馏法提取挥发油，挥发油得率为1.43%，临用时用2%聚山梨酯80稀释至给药浓度。2.2秃叶黄檗果实水煎液和挥发油的止咳祛痰活性考察2.2.1止咳活性考察采用氨水引咳实验进行考察，具体操作参照文献[9]。取小鼠60只，雌雄各半，随机分为6组：正常对照组（生理盐水），右美沙芬组（阳性对照氢溴酸右美沙芬片，15 mg/kg），秃叶黄檗果实水煎液高、低剂量组（后文简称为“水煎液高、低剂量组”，给药剂量以生药量计分别为12、3 g/kg），秃叶黄檗果实挥发油高、低剂量组（后文简称为“挥发油高、低剂量组”，给药剂量以挥发油量计分别为0.8、0.2 g/kg），每组10只。灌胃相应药物/生理盐水，每天1次，连续7 d。末次灌胃后0.5 h，将小鼠放入1 000 mL烧杯中，再迅速放入注有0.4 mL浓氨水的棉球刺激小鼠，以小鼠腹肌强烈收缩且张嘴为咳嗽动作指标，记录其咳嗽潜伏期和2 min内咳嗽次数。采用SPSS 26.0软件对数据进行统计分析。实验结果以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步的组间两两比较采用LSD-t检验；检验水准α＝0.05。结果显示，与正常对照组比较，各给药组小鼠的咳嗽潜伏期均显著延长（P＜0.05或P＜0.01），右美沙芬组、水煎液高剂量组和挥发油高剂量组小鼠2 min内咳嗽次数均显著减少（P＜0.05或P＜0.01）。结果见表1。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.17.12.T001表1各组小鼠的咳嗽潜伏期、2 min内咳嗽次数及气管中酚红分泌量测定结果（x±s，n＝10）组别咳嗽潜伏期/s2 min内咳嗽次数/次酚红分泌量/（μg/mL）正常对照组45.20±5.21344.30±1.8620.91±0.079右美沙芬组/氯化铵组69.90±4.375a31.40±1.368a1.36±0.070a水煎液高剂量组68.90±4.100a35.10±0.936b1.45±0.121a水煎液低剂量组57.80±3.593b42.50±5.6361.22±0.119b挥发油高剂量组68.70±3.887a34.20±3.010b1.19±0.037b挥发油低剂量组55.00±5.108b36.80±2.7521.12±0.058a：与正常对照组比较，P＜0.01；b：与正常对照组比较，P＜0.05。2.2.2祛痰活性考察采用药物祛痰小鼠实验进行考察。动物选取及给药方式同“2.2.1”项，阳性对照药变更为氯化铵（1 g/kg）。末次给药0.5 h后，各组小鼠按1 g/kg腹腔注射5%酚红溶液，0.5 h后颈椎脱臼处死小鼠。取下气管放入2 mL生理盐水中，加1 mol/L NaOH溶液0.2 mL，以3 000 r/min离心15 min，取上清液于酶标仪546 nm波长处测定光密度（OD）值。根据标准曲线Y＝0.059 6X－0.028 3（R2＝0.996 9）（式中X为酚红质量浓度，Y为OD值）计算气管中酚红分泌量。数据结果按“2.2.1”项下方法进行统计学分析。结果显示，与正常对照组比较，氯化铵组和水煎液高剂量组、水煎液低剂量组、挥发油高剂量组小鼠气管中的酚红分泌量均显著增加（P＜0.05或P＜0.01）。结果见表1。2.3秃叶黄檗果实挥发油的GC-MS成分分析2.3.1色谱条件色谱柱为Agilent HP-5MS柱（30 m×250 μm×0.25 μm）；采用程序升温：初始温度50 ℃，保持2 min，以4 ℃/min升温至280 ℃，保持2 min；进样口温度为280 ℃；载气为氦气，流速为1.0 mL/min；分流比为20∶1；进样量为1 μL。2.3.2质谱条件电离方法为电子轰击电离（electron ionization，EI）；电子能量为70 eV；离子源温度为230 ℃；质量扫描范围为20～450；质谱检索标准库为NIST14。2.3.3GC-MS分析供试品溶液的制备取秃叶黄檗果实打粉，过三号筛，精密称取粉末约100 g，采用水蒸气蒸馏法提取挥发油，得淡黄色挥发油液体约1.5 mL。加入无水硫酸钠约0.5 g，静置过夜，以除去水分。取挥发油约1.0 mL置于10 mL容量瓶中，用无水乙醚定容，以0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。2.3.4数据处理及结果分析将所得质谱裂解数据信息与NIST14数据库匹配，得到匹配度≥90%的化合物共38个，总离子流图见图1。其中，相对百分含量＞1%的主要化合物有8个，分别为α-蒎烯（1.27%）、月桂烯（64.08%）、石竹烯（1.07%）、germacrene D（2.77%）、isospathulenol（1.08%）、α-cadinol（1.32%）、4（15），5，10（14）-大根香叶三烯-1-醇（1.24%）、金合欢醇（1.29%），具体化合物的匹配度与相对百分含量信息见表2。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.17.12.F001图1秃叶黄檗果实挥发油的GC-MS总离子流图10.6039/j.issn.1001-0408.2023.17.12.T002表2秃叶黄檗果实主要挥发油成分及其相对百分含量编号保留时间/min分子量名称分子式相对百分含量/%匹配度/%16.229136.234α-蒎烯C10H161.279628.431136.234月桂烯C10H1664.0897322.502204.351石竹烯C15H241.0799424.468204.351germacrene DC15H242.7799528.930220.350isospathulenolC15H24O1.0899629.618222.366α-cadinolC15H26O1.3296730.525220.3504（15），5，10（14）-大根香叶三烯-1-醇C15H24O1.2499831.474222.366金合欢醇C15H26O1.29972.4秃叶黄檗果实非挥发油的UPLC-Q-Orbitrap HRMS成分分析2.4.1色谱条件采用Thermo Acclaim RSLC 120 C18色谱柱（100 mm×3 mm×2.2 μm），以0.1%甲酸溶液（A）-0.1%甲酸乙腈溶液（B）为流动相进行梯度洗脱（0～5 min，5%B→8%B；5～12 min，8%B；12～13 min，8%B→10%B；13～17 min，10%B；17～25 min，10%B→15%B；25～28 min，15%B→22%B；28～32 min，22%B→25%B；32～35 min，25%B；35～42 min，25%B→28%B；42～48 min，28%B→30%B；48～52 min，30%B→55%B；52～63 min，55%B→100%B）；流速为0.2 mL/min；柱温为35 ℃；进样量为2 μL。2.4.2质谱条件采用电喷雾离子源，在正、负离子模式下检测。喷雾电压为3.5 kV；辅助气温度为350 ℃；辅助气流速为10 arb；鞘气流速为35 arb；离子传输管温度为320 ℃。扫描模式为全扫描/数据依赖二级扫描（Full MS/dd-MS2），一级分辨率为70 000，二级分辨率为17 500；扫描范围为m/z 100～1 500；阶梯碰撞能量为20、40、60 eV。2.4.3对照品溶液的制备取甜菜碱、葫芦巴碱、熊果苷、红景天苷、秦皮甲素、绿原酸、黄柏碱、槲皮素、山柰酚、延胡索乙素、小檗红碱、药根碱、巴马汀、小檗碱、木犀草素、吴茱萸碱、柠檬苦素和黄柏酮对照品各适量，置于同一容量瓶中，加入甲醇配制成各成分质量浓度均约为100 μg/mL的混合对照品溶液，混匀，用0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。2.4.4UPLC-MS分析供试品溶液的制备精密称取秃叶黄檗果实粉末1.0 g，置于50 mL锥形瓶中，加入30 mL甲醇，超声（功率45 kHz，频率250 W）处理30 min，过滤，滤液旋转蒸干，加入适量甲醇溶解后，置于10 mL容量瓶中并以甲醇定容，以0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。2.4.5数据处理及结果将采集得到的原始数据导入Compound Discoverer 3.0软件，通过其向导设置及方法模板，建立未知化合物的鉴定流程，对原始数据进行峰对齐和峰提取。通过提取得到的分子离子色谱峰、同位素峰拟合出可能的分子式，并将二级碎片实测谱图与mzCloud网络数据库及本地中药成分数据库OTCML进行匹配，对匹配结果设置过滤参数为：峰面积阈值80 000，一级及二级质量偏差5 ppm，匹配度分值高于80。对过滤后的离子与数据库中的化合物信息及对照品进行比对，结合相关文献和在线数据库（PubChem）对化学成分进行进一步的分析鉴定。结果，通过UPLC-Q-Orbitrap HRMS技术，共从秃叶黄檗果实中鉴定出69个化合物，包括酚酸类化合物16个、生物碱类化合物13个、黄酮类化合物10个、氨基酸类化合物7个、核苷类化合物5个、香豆素类化合物3个、三萜类化合物3个、其他类化合物12个，其中18个化合物经过对照品比对确认。在正、负离子检测模式下，秃叶黄檗果实供试品及混合对照品UPLC-Q-Orbitrap HRMS的总离子流图见图2，具体化合物信息见表3。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.17.12.F002图2秃叶黄檗果实与混合对照品UPLC-Q-Orbitrap HRMS的总离子流图1：甜菜碱；2：葫芦巴碱；3：熊果苷；4：红景天苷；5：秦皮甲素；6：绿原酸；7：黄柏碱；8：槲皮素；9：山柰酚；10：延胡索乙素；11：小檗红碱；12：药根碱；13：巴马汀；14：小檗碱；15：木犀草素；16：吴茱萸碱；17：柠檬苦素；18：黄柏酮。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.17.12.T003表3秃叶黄檗果实非挥发性化学成分分析结果峰号tR/min分子式准分子离子峰误差/ppm二级碎片m/z化合物类别11.02C6H14N4O2175.119 14[M+H]+1.07175.119 06，158.092 44，130.097 67，116.070 94精氨酸a氨基酸类21.11C5H13NO104.107 38[M+H]+3.7487.039 20，60.081 51胆碱a其他类31.16C6H12O7195.050 66[M－H]－－1.88177.039 96，159.029 24，141.018 37，129.018 57葡萄糖酸a酚酸类4b1.17C5H11NO2118.086 60[M+H]+2.9272.081 50，59.073 73甜菜碱a生物碱类5b1.19C7H7NO2138.055 10[M+H]+1.05138.055 11，94.065 71葫芦巴碱a生物碱类61.20C5H9NO2116.070 95[M+H]+2.97116.070 99，70.065 85脯氨酸a氨基酸类71.21C7H12O6191.055 51[M－H]－－3.15191.055 65，173.045 27，146.937 67，59.012 74奎尼酸a酚酸类81.23C9H13N3O5244.093 03[M+H]+0.95112.050 93胞苷a核苷类91.26C7H13NO2144.102 07[M+H]+1.1484.081 42，58.065 90水苏碱a生物碱类101.37C5H5N5136.062 03[M+H]+1.90137.045 97，136.061 87，119.049 35腺嘌呤a核苷类111.48C4H6O5133.013 65[M－H]－－4.49115.002 84，89.023 47，71.012 86苹果酸a酚酸类121.49C7H10O5173.045 01[M－H]－－3.10173.045 24，137.023 79，111.007 88，93.033 49莽草酸a酚酸类131.71C5H11NO2118.086 62[M+H]+3.09118.086 56，72.081 44缬氨酸a氨基酸类141.76C6H8O7191.019 30[M－H]－－2.23191.019 27，173.008 59，147.029 34，129.018 54，111.007 90柠檬酸a酚酸类151.77C5H7NO3130.050 16[M+H]+2.23130.050 13，112.086 99，84.045 01，69.023 94焦谷氨酸a氨基酸类161.81C6H6O3127.039 24[M+H]+2.12127.039 22，109.028 81，81.034 13，55.018 64麦芽酚a其他类171.86C6H6O6173.008 70[M－H]－－2.67129.018 55，85.028 55顺乌头酸a酚酸类182.00C10H13N5O5284.099 24[M+H]+1.04284.098 69，153.053 63，152.056 82鸟苷a核苷类19b2.07C12H16O7271.082 49[M－H]－0.60109.028 64，108.020 80熊果苷a酚酸类202.26C10H13NO2180.102 11[M+H]+1.14180.102 01，163.075 47，145.064 90，137.059 86salsolinola其他类212.30C6H13NO2132.102 10[M+H]+1.47132.102 11，131.974 35，86.097 05亮氨酸a氨基酸类222.33C5H6O4129.018 76[M－H]－－4.43129.054 75，93.037 84，85.028 56柠康酸a酚酸类232.71C11H15N5O4282.120 09[M+H]+1.45282.119 75，136.061 902′-O-甲基腺苷a核苷类242.76C7H6O5169.013 98[M－H]－－1.58125.023 61，107.012 58，97.028 61没食子酸a酚酸类253.40C10H14N2O5241.083 28[M－H]－1.18241.082 93，151.050 48，125.034 56胸苷a核苷类263.53C12H16N2O205.133 90[M+H]+1.76205.133 90，160.075 87，132.080 93，58.065 88蟾蜍色胺a其他类273.70C9H11NO2166.086 55[M+H]+1.77166.086 26，149.059 97，120.081 05，105.054 68L-苯丙氨酸a氨基酸类284.29C10H9NO2176.070 85[M+H]+1.39176.070 76，130.065 38，128.522 72杂茁长素a其他类294.37C5H8O4131.034 37[M－H]－－4.67131.034 18，87.044 182-甲基琥珀酸a酚酸类304.88C9H17NO5220.118 26[M+H]+1.41220.097 11，202.107 27，184.096 94，116.034 52pantothenic acida酚酸类315.30C7H6O4153.018 71[M－H]－－4.06154.026 37，153.007 72，109.028 62，108.028 01龙胆酸a酚酸类326.32C9H8O4181.049 70[M－H]－0.91181.049 84，164.079 37，163.039 08，145.028 59咖啡酸a酚酸类337.27C12H12N2O201.102 54[M+H]+1.49201.102 33，160.075 82，132.958 83去甲骆驼蓬碱a生物碱类34b7.28C14H20O7299.113 98[M－H]－1.18119.049 28，101.023 51，89.023 45，71.012 83红景天苷a其他类357.62C11H20N2O5261.144 91[M+H]+1.57261.144 99，198.112 72，132.102 10，86.097 02谷氨酰亮氨酸a氨基酸类36b7.78C15H16O9341.087 13[M+H]+1.24179.034 01，133.063 05，123.044 36秦皮甲素a香豆素类3710.37C11H14N2175.123 08[M+H]+0.60175.123 17，144.080 89，132.080 96，118.065 39N-ω-甲基色胺a其他类38b10.45C16H18O9353.087 86[M－H]－0.15353.087 65，191.055 60，179.034 35，173.044 39绿原酸a酚酸类3912.61C16H18O9353.087 86[M－H]－0.15191.055 16，179.034 41隐绿原酸a酚酸类40b15.62C20H24NO4342.170 47[M+H]+－0.18342.170 07，192.101 92黄柏碱a生物碱类4116.26C18H21NO3300.159 79[M+H]+1.23302.166 17，301.163 12，300.159 61可代因a其他类4217.82C9H6O4177.018 98[M－H]－－1.99149.023 67，132.971 59，105.033 67瑞香素a香豆素类4321.55C8H8O4167.034 45[M－H]－－3.18152.010 97，123.044 29，108.020 90香草酸a酚酸类4425.17C14H15N198.127 98[M+H]+1.28198.127 79，181.101 35，106.065 57，91.054 79二苄胺a其他类4528.50C21H20O12465.102 87[M+H]+0.25303.050 02，85.028 98异槲皮素a黄酮类46b28.89C15H10O7303.049 84[M+H]+－0.29285.039 61，274.047 61，257.044 37，229.049 65槲皮素a黄酮类47b29.28C21H25NO4356.185 79[M+H]+0.44192.101 91，165.091 57，27.101 96延胡索乙素生物碱类4829.41C15H14O4259.096 77[M+H]+1.10259.096 62，244.073 07，243.066 27，229.049 59鲁望桔内酯a香豆素类4929.58C20H17NO5352.118 29[M+H]+0.97352.154 27，337.130 87，322.107 21氧海罂粟碱a生物碱类5029.75C20H18O11433.078 22[M－H]－1.35433.077 85，301.001 01，300.027 68，271.024 86槲皮素-3-O-D-木糖苷a黄酮类5129.83C21H20O11447.094 06[M－H]－1.73447.093 63，284.032 75，255.029 89，227.034 76黄芪苷a黄酮类52b30.40C15H10O6287.055 11[M+H]+0.33258.025 40，241.050 23，213.065 34，153.018 26山柰酚a黄酮类5330.41C21H20O11447.093 72[M－H]－0.97447.093 17，285.040 65，284.032 81三叶豆苷a黄酮类54b31.42C19H15NO4322.107 36[M+H]+－0.08307.083 80，292.059 60，279.088 90，278.080 99小檗红碱a生物碱类55b31.58C20H19NO4338.138 70[M+H]+0.05323.115 11，322.107 42，308.091 77，294.112 34药根碱a生物碱类5633.32C17H17NO3284.128 48[M+H]+1.26147.044 17，121.065 12N-反式-对香豆酰酪胺a生物碱类57b34.16C21H22NO4352.154 36[M+H]+－1.49337.130 98，336.123 14，322.107 39，308.127 96巴马汀a生物碱类58b35.11C20H17NO4336.123 11[M+H]+0.24321.099 40，320.091 83，306.075 99，292.096 80小檗碱a生物碱类5941.98C15H10O5269.045 90[M－H]－1.31159.044 31，135.044 69，133.028 98染料木素a黄酮类60b43.97C15H10O6285.040 59[M－H]－0.46151.002 35，133.029 24木犀草素a黄酮类6145.62C16H12O7315.051 54[M－H]－1.63300.027 74，271.024 84，255.029 07，243.029 013-O-甲基槲皮素a黄酮类6251.10C26H30O9485.1802 04[M－H]－－3.10423.180 91，397.165 99，383.150 15吴茱萸苦素a三萜类63b52.37C26H30O8471.201 29[M+H]+－0.12471.203 25，425.196 17，161.059 74，105.070 39柠檬苦素a三萜类6453.96C18H39NO3318.300 29[M+H]+0.06318.300 23，300.289 83，282.279 30植物鞘氨醇a其他类65b54.01C19H17N3O304.144 59[M+H]+0.50286.098 91，171.091 69，161.070 48，144.080 75吴茱萸碱a生物碱类6654.03C20H20O5339.123 90[M－H]－0.30219.066 09，176.011 09，151.075 78，133.065 128-异戊烯基柚皮素a黄酮类67b54.52C26H30O7455.206 48[M+H]+0.11455.206 79，161.059 80黄柏酮a三萜类6855.60C8HF15O2412.966 74[M－H]－0.76368.976 90，218.985 78，168.988 86全氟辛酸a其他类6963.41C18H35NO282.279 11[M+H]+－0.11265.253 02，247.242 72，149.132 80油酸酰胺a其他类a：与PubChem数据库中LC-MS碎片离子信息匹配；b：已与对照品确认。2.5网络药理实验筛选秃叶黄檗果实祛痰止咳的活性成分及机制2.5.1活性成分的筛选以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）＞30%和类药性（drug-likeness，DL）＞0.18为筛选条件对“2.3”和“2.4”项下所鉴定出的秃叶黄檗果实的化学成分进行活性筛选[10]。结果显示，满足筛选条件的化学成分共有10个，包括槲皮素、延胡索乙素、山柰酚、小檗红碱、药根碱、巴马汀、小檗碱、木犀草素、吴茱萸苦素、黄柏酮。此外，虽然所鉴定成分中α-蒎烯和月桂烯的DL值略低于0.18，绿原酸的OB值略低于30%，但据报道[6，11―12]，三者均具有良好的祛痰止咳活性，故也纳入后续研究中。因此，共筛选获得13个活性成分。2.5.2潜在作用靶点预测通过SwissTargetPrediction、TCMSP和SuperPred等数据库共获得活性成分的靶点681个，以“cough”和“expectoration”为关键词，通过GeneCards数据库获得与咳嗽和咳痰相关的疾病靶点378个。在Venny2.1.0在线作图工具平台上获取两者交集靶点，即为潜在作用靶点，共57个。2.5.3蛋白互作网络构建和核心靶点获取通过String数据库对潜在作用靶点进行蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）网络关系数据分析，使用Cytoscape 3.7.1软件对数据结果进行可视化分析，选取连接度最大的5个节点作为核心作用靶点，结果见图3。图3中包含55个节点，节点的颜色由浅逐渐变深，而颜色越深表示节点的连接度越大；核心靶点为肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（serine/threonine kinase proteins，AKT1）、Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.17.12.F003图3秃叶黄檗果实祛痰止咳靶点的PPI网络图2.5.4通路富集分析利用DAVID网站对潜在作用靶点进行GO富集分析和KEGG信号通路富集分析，以P＜0.05进行筛选，共得到生物过程通路233条、细胞组成通路35条、分子功能通路49条，均选择其中P值排前10位的条目绘制GO富集分析条形图，见图4A。结果显示，GO功能条目包括对脂多糖的反应、肽基丝氨酸磷酸化的正向调节、一氧化氮生物合成过程的积极调节等生物过程。同样选择P值排前10位的KEGG信号通路绘制KEGG分析气泡图，结果见图4B。结果显示，KEGG信号通路包括癌症、非小细胞肺癌、癌症中的蛋白聚糖等信号通路。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.17.12.F004图4秃叶黄檗果实祛痰止咳GO富集分析条形图和KEGG富集分析气泡图2.5.5分子对接验证使用AutoDock Tools 1.5.6软件将“2.5.1”项下筛选获得的活性成分、镇咳阳性药物右美沙芬与“2.5.3”项下分析所得的5个核心作用靶点进行分子对接，结果见表4。一般认为，对接结合能≤－5.0 kcal/mol（1 cal＝4.184 J），说明两者结合活性较好[13]。本研究中，除靶点VEGFA与成分月桂烯和α-蒎烯的结合能略大于－5.0 kcal/mol外，其他成分和靶点的结合能均不大于－5.0 kcal/mol，提示其均具有较好的结合能力。这说明所筛选的活性成分均有可能是秃叶黄檗果实祛痰止咳的物质基础成分。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.17.12.T004表4右美沙芬、秃叶黄檗果实活性成分与核心靶点分子的对接结合能（kcal/mol）活性成分核心作用靶点（作用位点）TNF（6m95）EGFR（8a2b）VEGFA（6zfl）TLR4（5uc9）AKT1（3mvh）右美沙芬－7.0－7.2－5.7－7.8－8.1小檗碱－8.2－9.8－7.0－8.9－10.9小檗红碱－9.1－9.8－7.6－9.0－11.0绿原酸－8.1－7.9－6.7－8.4－9.1药根碱－8.2－8.9－6.3－8.7－8.9山柰酚－8.6－8.9－6.6－8.0－9.0木犀草素－9.4－8.8－6.5－8.2－9.5月桂烯－5.6－5.4－4.3－5.9－5.9黄柏酮－7.9－8.4－7.5－10.6－11.2巴马汀－7.2－8.6－6.3－7.9－10.1α-蒎烯－6.6－5.7－4.3－6.4－5.7槲皮素－8.6－8.9－6.5－8.0－8.9吴茱萸苦素－7.4－8.3－7.3－9.9－11.6延胡索乙素－8.3－8.7－6.1－8.6－9.13讨论据报道，黄檗果实水煎液祛痰止咳的治疗剂量以每日15 g为宜[5]。以成人体质量60 kg计，按照小鼠与人剂量的换算系数12.3计算，得到小鼠给药剂量约为3 g/kg。另有研究表明，灌胃给予小鼠0.2～0.8 g/kg的黄檗果实挥发油对小鼠有明显的祛痰作用[6]。本研究参考黄檗果实的治疗剂量，将12、3 g/kg和0.8、0.2 g/kg分别作为水煎液和挥发油祛痰止咳的高、低治疗剂量。此外，氯化铵在药物祛痰实验研究中常被用作阳性对照药物；右美沙芬属于非成瘾性中枢镇咳药，主要通过抑制延髓咳嗽中枢而发挥镇咳作用，常被用作小鼠镇咳实验的阳性对照药物。故本研究选择右美沙芬和氯化铵作为阳性对照药物，其给药剂量参考文献[9]设置。本研究结果表明，秃叶黄檗果实水煎液和挥发油均具有明显的祛痰止咳作用，并呈明显的剂量依赖趋势。晏晨等[14]研究发现，不同产地川黄檗果实的挥发油化学成分组成有较大差异。蒋太白等[8]研究表明，贵州产秃叶黄檗果实的挥发油主要成分为月桂烯（相对百分含量为66.9%）。本研究首次鉴定了四川产秃叶黄檗果实挥发油的化学成分组成，发现其主要成分同样为月桂烯（相对百分含量为64.08%），表明不同产地秃叶黄檗果实的挥发油化学成分组成具有良好的一致性。本研究首次采用UPLC-MS技术对秃叶黄檗果实非挥发性成分进行鉴定分析，共鉴定出酚酸类、生物碱类、黄酮类等69个化合物，进一步补充完善了其化学成分的研究。笔者查阅所鉴定出的化合物的祛痰止咳活性研究报道后发现，α-蒎烯具有祛痰止咳的活性，是祛痰药桉柠蒎肠溶软胶囊的指标性成分之一[11]。据《中华本草》记载，黄檗果实挥发油镇咳作用的有效单体为月桂烯[7]；绿原酸为返魂草、石韦等祛痰止咳中药的指标成分之一[12，15]；木犀草素为石韦、筋骨草和三子养亲汤等祛痰止咳中药和方剂的指标成分之一[15―16]；小檗碱为藏成药十味龙胆花颗粒的指标成分之一，适用于治疗慢性支气管炎[17]。且分子对接结果表明，上述成分与祛痰止咳核心靶点间均有较好的结合活性。因此，笔者推断α-蒎烯、月桂烯、绿原酸、木犀草素和小檗碱等成分可能为秃叶黄檗果实祛痰止咳的物质基础。笔者利用网络药理学探究了秃叶黄檗果实祛痰止咳的作用机制，发现其核心作用靶点为TNF、EGFR、VEGFA、AKT1和TLR4。其中，TNF可诱导氧自由基的产生并导致组织损伤，还可以进一步激活核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）通路中炎症介质的转录和表达，促进炎症的发生和发展[18]。TLR4被激活后可通过一系列级联反应激活NF-κB，使其入核并结合促炎基因启动子，从而增强炎症基因表达，释放炎症细胞因子[19]。AKT在细胞生长、迁移、增殖、炎症和血管生成方面有重要作用，其亚型AKT1参与细胞的生长与存活，并在多种组织中表达[20]。咳嗽、咳痰是慢性支气管炎患者最典型的症状，现代医学认为慢性支气管炎是因感染或其他非感染因素引起的支气管及其周围组织的非特异性炎症。这说明，秃叶黄檗果实挥发油和水煎液可能主要通过缓解支气管及其周围组织的非特异性炎症从而达到祛痰止咳的作用。GO分析和KEGG富集分析结果表明，秃叶黄檗果实祛痰止咳的作用机制主要是通过影响脂多糖的反应、肽基丝氨酸磷酸化的正向调节、一氧化氮生物合成过程的积极调节等生物过程，调节癌症、非小细胞肺癌、癌症中的蛋白聚糖等信号通路。综上所述，秃叶黄檗果实主要通过作用于TNF、EGFR、VEGFA、AKT1和TLR4等靶点及其显著富集的信号通路发挥祛痰止咳的作用，其物质基础可能为α-蒎烯、月桂烯、绿原酸、木犀草素和小檗碱等成分。但是，本研究仅对秃叶黄檗果实的化学成分作了GC-MS和UPLC-MS的定性分析，以及通过网络药理学分析了其祛痰止咳的物质基础，缺乏对物质基础化学成分的定量分析。本课题组后续将继续开展对物质基础成分的定量研究工作，为秃叶黄檗果实资源的进一步开发利用研究奠定理论基础。