心痛舒喷雾剂（国药准字Z20194075）由牡丹皮、川芎及冰片3味中药制备而成，在临床上用于治疗痰浊瘀血痹阻心脉而致的冠心病心绞痛；其经舌下喷雾给药，被毛细血管吸收后直接进入体循环，起效快，疗效确切，在心血管疾病急救方面具有独特优势[1―2]。中药复方具有多成分、多靶点、综合作用的特点，其药效的发挥是多成分协同作用的结果[3]。现行的心痛舒喷雾剂质量控制标准收载于《国家药品标准新药转正标准》第42册[4]，主要为单味中药薄层鉴定及单一成分含量测定，无法反映出整体的质量情况，同时也未见国内外关于心痛舒喷雾剂质量控制的研究。为保障中药复方的质量及临床药效的发挥，有必要建立一种简单、高效、准确的指纹图谱和多成分含量测定方法，以应用于企业的生产和质检。中药复方指纹图谱和多成分含量测定研究是保障其质量的基础，而对中药复方质量的提升研究也同样重要。中药复方质量的提升离不开对其制备工艺的研究和优化，而通过探究“指标成分”在中药复方制备过程中的传递规律，则有利于发现和优化影响其质量的关键工艺。基于此，本研究建立心痛舒喷雾剂高效液相色谱（HPLC）指纹图谱，对其指认成分进行含量测定；再以该喷雾剂中牡丹皮、川芎药材的质控成分丹皮酚和阿魏酸为“指标成分”[5]，探究指标成分在饮片、中间体、喷雾剂中的传递规律，以期为心痛舒喷雾剂的工艺把关和质量控制提供参考。1材料1.1主要仪器Waters ACQITY Arc型HPLC仪购自美国Waters公司；YL-060ST型超声波清洗器购自深圳市语路清洗设备有限公司；AB135-S型电子分析天平购自赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；BT-25S型高速离心机购自常州市万丰仪器制造有限公司；HX-200型中药粉碎机购自永康市溪岸五金药具厂。1.2主要药品与试剂没食子酸、氧化芍药苷、绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ的对照品（批号分别为J05GB153704、N26GB169459、A22GB158496、G13S11L124423、PZ7A11F122339，纯度均≥98.0%）均购于上海源叶生物科技有限公司；咖啡酸、芍药苷、丹皮酚的对照品（批号分别为PS010522、PS000825、PS000281，纯度均≥98.0%）均购于成都普思生物科技有限公司；吐温-80（药用级）购于上海麦克林生化科技有限公司；乙腈、甲醇为色谱纯，甲酸为分析纯，水为娃哈哈纯净水。牡丹皮、川芎、冰片饮片和13批心痛舒喷雾剂（批号分别为20221001、20221002、20221003、20221004、20221005、20221006、20221007、20221008、20221009、20221010、20220101、20220201、20220202，编号S1～S13）均由华佗国药股份有限公司提供。另外，本实验室自制了心痛舒喷雾剂6批，编号S14～S19。2方法与结果2.1色谱条件色谱柱为East Laboratory Epic C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脱（0～10 min，10%A→15%A；10～24 min，15%A→25%A；24～28 min，25%A→26%A；28～30 min，26%A→30%A；30～48 min，30%A→57%A；48～52 min，57%A→80%A；52～57 min，80%A→10%A；57～62 min，10%A）；流速为0.8 mL/min；柱温为30 ℃；进样量为10 μL；检测波长分别为254、320 nm（指纹图谱研究时选择254 nm；含量测定时选择254 nm作为没食子酸、氧化芍药苷、芍药苷、洋川芎内酯Ⅰ、丹皮酚的检测波长，320 nm作为绿原酸、咖啡酸、阿魏酸的检测波长）。2.2心痛舒喷雾剂的制备按心痛舒喷雾剂现行工艺进行制备[4]，具体为：取牡丹皮235 g，用80%乙醇浸渍48 h，再用65%乙醇缓缓渗漉（料液比约为1∶12），收集漉液，减压回收乙醇，得牡丹皮流浸膏，备用。取川芎392 g，用水蒸气蒸馏法提取挥发油，挥发油用乙醇溶解后，备用；提取挥发油后的药液滤出，药渣再加水煎煮2 h，煎液与上述药液合并，滤过，得川芎水提液；将该水提液减压浓缩至适当相对密度，加乙醇使含醇量达60%，静置48 h，滤过；滤液减压回收乙醇，并浓缩至适量，得川芎醇沉浓缩液，备用。取19 g冰片与20 mL吐温-80，加适量乙醇混匀，备用。将上述备用的药液合并，用乙醇及蒸馏水调整药液总量为1 000 mL并使含醇量＜30%，混匀，滤过，即得。2.3溶液的制备2.3.1混合对照品溶液的制备精密称取没食子酸、氧化芍药苷、绿原酸、咖啡酸、芍药苷、阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、丹皮酚对照品适量至容量瓶中，加入75%甲醇制备成质量浓度分别为69.0、72.8、34.8、11.0、366.0、24.2、31.4、379.0 μg/mL的混合对照品溶液。2.3.2供试品溶液的制备（1）心痛舒喷雾剂供试品溶液的制备：精密吸取心痛舒喷雾剂药液1 mL至20 mL容量瓶中，加75%甲醇至刻度，摇匀，过0.22 μm有机微孔滤膜，取续滤液即得。（2）饮片供试品溶液的制备：取牡丹皮、川芎饮片粗粉各0.5 g至锥形瓶，加75%甲醇50 mL，超声（频率40 kHz，功率360 W）提取30 min；补足失重，离心，取上清液，过0.22 μm有机微孔滤膜，取续滤液即得。（3）中间体供试品溶液的制备：按“2.2”项下处方中各饮片量与制备工艺，制得牡丹皮渗漉液和流浸膏样品，川芎水提液和醇沉浓缩液样品，分别按“2.3.2（1）”项下方法制备即得。（4）阴性对照供试品溶液制备：按“2.2”项下处方中各饮片量与制备工艺，制得缺川芎、缺牡丹皮的阴性对照样品，分别按“2.3.2（1）”项下方法制备即得。2.4心痛舒喷雾剂HPLC图谱的建立2.4.1精密度试验取S1号心痛舒喷雾剂样品，按“2.3.2（1）”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行检测，连续进样6次，获取色谱图。以31号峰（丹皮酚，下同）为参照峰，计算得各共有峰的相对保留时间RSD＜0.13%，相对峰面积RSD＜2.99%（n＝6），符合中药指纹图谱的要求。2.4.2重复性试验取S1号心痛舒喷雾剂样品，按“2.3.2（1）”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行检测，获取色谱图。以31号峰为参照峰，计算得各共有峰的相对保留时间RSD＜0.18%，相对峰面积RSD＜4.46%（n＝6），符合中药指纹图谱的要求。2.4.3稳定性试验取S1号心痛舒喷雾剂样品，按“2.3.2（1）”项下方法制备供试品溶液，分别在室温放置0、2、4、8、12、24 h时按“2.1”项下色谱条件进行检测，获取色谱图。以31号峰为参照峰，计算得各共有峰的相对保留时间RSD＜0.21%，相对峰面积RSD＜3.51%（n＝6），符合中药指纹图谱的要求。2.4.4指纹图谱的建立和相似度评价取13批（编号S1～S13）心痛舒喷雾剂样品，按“2.3.2（1）”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行检测。将获取的色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》，将S1批次设为参照图谱，对照图谱生成方法选择平均数法，时间窗宽度设为0.1，经过多点校正后进行峰匹配获得对照图谱R及13批样品的叠加图谱，如图1所示。结果显示，共标定共有峰33个，其中31号峰（丹皮酚）峰面积最大，分离度较好，故选择31号峰为参照峰；各批次心痛舒喷雾剂样品与对照图谱的相似度均≥0.994，表明各批次样品之间的差异性较小。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.23.08.F001图113批心痛舒喷雾剂的指纹图谱和对照图谱R2.4.5共有峰的指认和归属取“2.3.1”项下混合对照品溶液、“2.3.2（4）”项下阴性对照供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行检测，获得色谱图。如图2所示，将对照图谱R与混合对照品图谱进行比对，指认出5号峰为没食子酸、9号峰为氧化芍药苷、10号峰为绿原酸、14号峰为咖啡酸、17号峰为芍药苷、21号峰为阿魏酸、27号峰为洋川芎内酯Ⅰ、31号峰为丹皮酚。将对照图谱R与缺川芎、缺牡丹皮的阴性对照图谱进行对比发现，2、3、5、9、12、16～20、22、23、25、26、28～31号峰归属于牡丹皮；1～4、6～8、10、11、13～15、21、24、25、27、28、32、33号峰归属于川芎，其中2、3、25、28号峰同时归属于牡丹皮和川芎。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.23.08.F002图2各样品含量测定专属性试验的HPLC图谱5：没食子酸；9：氧化芍药苷；10：绿原酸；14：咖啡酸；17：芍药苷；21：阿魏酸；27：洋川芎内酯Ⅰ；31：丹皮酚。2.58个指认成分的含量测定2.5.1专属性试验取空白溶剂、混合对照品溶液、S1号心痛舒喷雾剂供试品溶液及阴性对照供试品溶液按“2.1”项下色谱条件进行检测，并记录色谱图。如图3所示，空白溶剂基线平整，除溶剂峰外无干扰峰；在各对照品成分的相应位置上，心痛舒喷雾剂供试品中均有色谱峰与之对应；阴性对照供试品中也无色谱峰干扰，表明该方法专属性较好，可以用于含量测定。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.23.08.F003图3专属性试验考察结果5：没食子酸；9：氧化芍药苷；10：绿原酸；14：咖啡酸；17：芍药苷；21：阿魏酸；27：洋川芎内酯Ⅰ；31：丹皮酚。2.5.2线性关系考察精密吸取“2.3.1”项下混合对照品溶液1.0、1.5、2.0、2.5、4.0、5.0 mL，分别置于5 mL容量瓶中，加75%甲醇稀释至刻度，摇匀；过0.22 μm有机微孔滤膜，取续滤液按“2.1”项下色谱条件进样分析，以进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），获得各成分的回归方程和线性范围，同时测定检测限和定量限，结果见表1。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.23.08.T001表18个成分的线性关系考察结果成分回归方程R2线性范围/（μg/mL）检测限/（μg/mL）定量限/（μg/mL）没食子酸Y＝22 955X－17 3520.999 913.80～69.000.180 60.602 0氧化芍药苷Y＝18 565X－10 5530.999 814.56～72.800.256 90.856 3绿原酸Y＝32 060X－60 2910.999 66.96～34.800.237 30.791 0咖啡酸Y＝61 547X－9 294.90.999 92.20～11.000.115 30.384 3芍药苷Y＝1 595.1X－337 80.999 973.20～366.000.376 81.256 0阿魏酸Y＝62 521X－127 641.000 04.84～24.200.096 50.321 7洋川芎内酯ⅠY＝29 271X+622.811.000 06.28～31.400.145 10.483 7丹皮酚Y＝16 507X+354 251.000 075.80～379.000.474 21.580 72.5.3精密度试验取“2.3.1”项下混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图。结果显示，没食子酸、氧化芍药苷、绿原酸、咖啡酸、芍药苷、阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、丹皮酚峰面积的RSD分别为0.02%、0.09%、0.06%、0.05%、0.10%、0.20%、0.11%、0.40%（n＝6），表明仪器精密度较好。2.5.4稳定性试验取S1号心痛舒喷雾剂样品，按“2.3.2（1）”项下方法制备供试品溶液，分别在室温放置0、2、4、8、12、24 h时按“2.1”项下色谱条件进行检测，记录色谱图。结果显示，没食子酸、氧化芍药苷、绿原酸、咖啡酸、芍药苷、阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、丹皮酚峰面积的RSD分别为0.26%、0.46%、0.16%、0.17%、0.20%、0.28%、0.09%、0.12%（n＝6），表明供试品溶液在室温放置24 h内稳定性较好。2.5.5重复性试验取S1号心痛舒喷雾剂样品，按“2.3.2（1）”项下方法平行制备供试品溶液6份，按“2.1”项下色谱条件进行检测，记录色谱图，然后代入回归方程中计算含量。结果显示，没食子酸、氧化芍药苷、绿原酸、咖啡酸、芍药苷、阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、丹皮酚含量的RSD分别为0.53%、0.27%、0.61%、0.68%、0.56%、0.38%、1.89%、0.57%（n＝6），表明方法重复性较好。2.5.6加样回收率试验取各对照品适量，用75%甲醇配制成没食子酸、氧化芍药苷、绿原酸、咖啡酸、芍药苷、阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、丹皮酚质量浓度分别为0.704、0.874、0.351、0.106、2.900、0.197、0.309、3.780 mg/mL的混合对照品溶液；精密吸取混合对照品溶液和已知浓度的心痛舒喷雾剂供试品溶液（编号S1）各0.5 mL，置于20 mL容量瓶中，加75%甲醇稀释至刻度，平行制备6份；再按“2.1”项下色谱条件进样分析，计算加样回收率。结果显示，上述8种的平均加样回收率分别为98.57%、100.34%、104.75%、98.81%、102.35%，97.04%、101.14%、98.20%，RSD分别为0.81%、1.50%、1.58%、1.31%、1.70%、2.69%、0.82%、0.19%（n＝6）。结果见表2。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.23.08.T002表28个成分的加样回收试验结果成分样品含量/mg加入量/mg测得量/ mg加样回收率/%平均加样回收率/%RSD/%没食子酸0.349 10.352 00.691 997.3998.570.810.349 10.352 00.695 798.470.349 10.352 00.698 399.200.349 10.352 00.693 797.900.349 10.352 00.698 999.380.349 10.352 00.697 999.09氧化芍药苷0.429 90.437 00.872 3101.24100.341.500.429 90.437 00.865 199.590.429 90.437 00.860 398.490.429 90.437 00.862 498.970.429 90.437 00.875 0101.850.429 90.437 00.875 1101.88绿原酸0.170 90.175 50.350 4102.28104.751.580.170 90.175 50.352 6103.530.170 90.175 50.355 7105.300.170 90.175 50.358 1106.670.170 90.175 50.357 3106.210.170 90.175 50.354 3104.50咖啡酸0.051 70.053 00.103 898.3098.811.310.051 70.053 00.103 798.110.051 70.053 00.104 699.810.051 70.053 00.105 2100.940.051 70.053 00.103 798.110.051 70.053 00.103 497.55芍药苷1.300 01.450 02.792 3102.92102.351.701.300 01.450 02.776 0101.791.300 01.450 02.804 1103.731.300 01.450 02.798 7103.361.300 01.450 02.736 499.061.300 01.450 02.797 3103.26阿魏酸0.093 40.098 50.185 793.7197.042.690.093 40.098 50.193 5101.620.093 40.098 50.188 396.350.093 40.098 50.189 397.360.093 40.098 50.189 297.260.093 40.098 50.187 995.94洋川芎内酯Ⅰ0.160 20.154 50.315 5100.52101.140.820.160 20.154 50.315 4100.450.160 20.154 50.315 3100.390.160 20.154 50.317 9102.070.160 20.154 50.316 6101.230.160 20.154 50.318 1102.20丹皮酚1.812 61.890 03.671 098.3398.200.191.812 61.890 03.672 398.401.812 61.890 03.670 998.321.812 61.890 03.668 898.211.812 61.890 03.665 498.031.812 61.890 03.663 297.922.5.7样品含量测定取心痛舒喷雾剂样品（编号S1～S13），按“2.3.2（1）”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行检测，记录各待测成分的峰面积，然后代入回归方程中计算含量，结果见表3。心痛舒喷雾剂的国家标准为丹皮酚含量＞1.6 mg/mL，企业内控标准为丹皮酚含量＞2.6 mg/mL、阿魏酸含量＞0.15 mg/mL，由此可见13批心痛舒喷雾剂均合格，但在成分的含量上存在一定差异。为探明影响心痛舒喷雾剂质量的关键工艺，本研究选择丹皮酚和阿魏酸为指标成分，进一步探究其在饮片、中间体、喷雾剂中的传递规律，全面剖析制备工艺。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.23.08.T003表38个成分的含量测定结果（n＝3，mg/mL）批次没食子酸氧化芍药苷绿原酸咖啡酸芍药苷阿魏酸洋川芎内酯Ⅰ丹皮酚S10.697 70.851 30.340 10.101 12.599 80.186 70.319 13.608 6S20.670 40.790 10.347 40.082 62.818 50.168 20.286 63.845 1S30.681 30.834 20.357 80.081 92.571 80.172 20.301 74.093 9S40.690 60.767 60.368 10.095 02.927 00.176 60.308 24.161 0S50.712 40.828 10.332 80.086 02.531 00.162 90.295 43.794 3S60.648 90.733 10.330 50.085 92.450 10.163 00.295 83.449 2S70.670 10.700 20.325 00.097 52.342 40.176 80.311 33.251 9S80.719 70.807 30.352 90.106 13.033 50.191 60.336 03.765 8S90.664 40.788 70.338 10.080 62.831 30.165 10.284 33.839 7S100.680 50.757 90.360 50.092 72.883 90.173 00.306 04.085 7S110.604 60.565 70.279 40.081 01.922 50.156 10.250 63.056 7S120.590 30.580 10.283 50.082 42.187 30.153 30.253 93.136 1S130.619 30.631 50.295 60.083 92.106 80.151 30.262 63.426 02.5.8指标成分的传递规律分析取S14～S19批次实验室自制的心痛舒喷雾剂样品和对应的牡丹皮、川芎饮片及牡丹皮渗漉液、流浸膏，川芎水提液、醇沉浓缩液等中间体样品，按“2.3.2”项下相应方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进行检测，记录各供试品中指标成分丹皮酚和阿魏酸的峰面积，代入回归方程中计算丹皮酚和阿魏酸两种指标成分在各样品中的总量，结果如表4和表5所示。结果显示，丹皮酚从饮片→喷雾剂总量的平均转移率为63.76%，在渗漉提取和减压蒸馏提取中损失较大，损失比例超30%；阿魏酸从饮片→喷雾剂总量的平均转移率为38.06%，在水蒸气蒸馏提取中损失较大，损失比例超50%。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.23.08.T004表4饮片、中间体、喷雾剂中丹皮酚的传递结果批次饮片中总量/g中间体中总量/g喷雾剂中总量/g饮片→喷雾剂总量的转移率/%饮片→喷雾剂总量的平均转移率/%渗漉液流浸膏S148.2246.8015.3275.27364.1263.76S157.8136.5404.8534.80861.54S167.9776.3224.7864.73459.35S177.6486.4515.3375.24168.53S187.4026.2434.7124.63362.60S197.5636.3795.0825.02566.4410.6039/j.issn.1001-0408.2023.23.08.T005表5饮片、中间体、喷雾剂中阿魏酸的传递结果批次饮片中总量/g中间体中总量/g喷雾剂中总量/g饮片→喷雾剂总量的转移率/%饮片→喷雾剂总量的平均转移率/%水提液醇沉浓缩液S140.4830.2120.1830.17636.4438.06S150.4960.2170.2030.19839.92S160.4750.2050.1900.18338.53S170.5100.2260.2110.20540.20S180.4940.2200.1850.17936.23S190.5020.2150.1920.18637.053讨论3.1色谱条件的优化本文考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸4种不同的流动相体系，结果显示，以乙腈-0.1%甲酸为流动相，所得色谱峰数量最多，且分离和响应效果最好。前期笔者参考相关文献[6―8]，对心痛舒喷雾剂供试品和对照品进行了全波长扫描，最终含量测定时选择254 nm作为没食子酸、氧化芍药苷、芍药苷、洋川芎内酯Ⅰ、丹皮酚的检测波长，选择320 nm作为绿原酸、咖啡酸、阿魏酸的检测波长；且发现在254 nm波长下色谱峰数目多、响应高、分离度较好，故选择254 nm作为指纹图谱的检测波长。笔者还考察了3种不同的柱温（25、30、35 ℃）和3种不同的流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）对色谱分离效果的影响，结果发现，在柱温30 ℃、流速0.8 mL/min时，色谱图峰形均较为对称，分离度较好。3.2心痛舒喷雾剂样品稀释溶剂的优化本文前期考察了10%甲醇、50%甲醇、75%甲醇、甲醇4种不同的样品稀释溶剂。结果发现，当采用10%甲醇和50%甲醇作为稀释溶剂时，色谱图峰面积降低，可能的原因是心痛舒喷雾剂中绝大多数成分为脂溶性成分，当稀释溶剂中水的含量升高时导致脂溶性成分不溶解，色谱峰面积降低；当采用甲醇作为样品稀释溶剂时，没食子酸和绿原酸的色谱峰均发生了前延与分叉，推测产生了溶剂化效应。因此，本研究最终选择75%甲醇作为稀释溶剂，所得色谱图峰形较为对称。3.3基于指标成分的传递规律分析心痛舒喷雾剂制备工艺复杂，其工艺参数上的不均一则可能导致质量上的差异。本文选取牡丹皮和川芎的药典质控成分丹皮酚和阿魏酸作为指标成分，探究其在饮片、中间体、喷雾剂中的传递规律。结果显示，牡丹皮的渗漉提取和减压浓缩及川芎的水蒸气蒸馏提取是指标成分显著损失的关键工艺。在牡丹皮的渗漉提取中，乙醇的浓度、用量和渗漉速度等参数均会影响丹皮酚的提取率，此外丹皮酚具有随水蒸气蒸馏的物理性质，因此减压浓缩时的温度、转速、真空度等参数也会显著影响丹皮酚的提取率。在川芎的水提工艺中阿魏酸损失较高，笔者查阅相关文献发现，川芎水提时阿魏酸转移率普遍较低，如高扬等[9]发现阿魏酸从饮片至标准汤剂的平均转移率为37.7%，莫雨佳等[10]发现阿魏酸从饮片至全方水煎液的平均转移率为45.97%。因此，笔者推测导致阿魏酸转移率低的主要原因与其水溶性较差有关，建议在水提川芎时，可以通过增加加水量、提取次数，添加乙醇和趁热过滤等操作来增加阿魏酸转移率。综上所述，本文建立的指纹图谱和多成分含量测定方法重复性好、专属性强，可以用于心痛舒喷雾剂的质量评价；其次，本文探明了丹皮酚和阿魏酸两种指标成分在饮片、中间体、喷雾剂中的传递规律，明确了影响心痛舒喷雾剂质量的关键工艺，可以为企业的生产和工艺优化提供参考。