健脾化瘀方是由名老中医、上海中医药大学钱伯文教授创制，并结合广东省人民医院中医内科王昌俊教授多年临床经验和实验研究进一步调整而成，用于肝癌术后治疗的经验方剂。该方由莪术、苦参、白花蛇舌草、茯苓、白术、佛手6味药材组成，具有化瘀散结、健脾理气、清热解毒化湿的功效。除了肝癌，该方还常用于胃癌、大肠癌等消化道肿瘤患者的治疗，症见脘腹疼痛、胁下痞块、口淡乏味、食欲不振、体倦乏力等。基础研究发现，健脾化瘀方能有效抑制肝癌细胞的增殖，并预防手术后肝癌的复发和转移[1]。临床研究表明，该方可明显提高患者的生活质量指数，避免肝功能恶化，改善血清肝纤维化指标，提高患者术后1、3、5年的生存率，尤其对肝癌患者术后早期生活质量有明显改善，如能明显缓解术后便秘、腹泻等症状[2]。鉴于中药复方制剂有效成分的多样性及复杂性，如何以更全面的方式表述制剂中的化学成分种类和数量，以确保制剂质量的相对一致，是学者们研究的重点问题。目前的研究认为，指纹图谱是一种灵敏而专一性强的质量控制方法，广泛用于中药制剂的质量控制[3]。当前，有关健脾化瘀方质量控制的研究仍显薄弱，基于此，本研究采用高效液相色谱（HPLC）法建立了该方的指纹图谱，并测定了方中绿原酸、香草酸、对香豆酸、阿魏酸、橙皮苷、槲皮素、佛手柑内酯、苦参碱的含量，从定性和定量两方面为该方的质量标准奠定基础，同时为该方后续的制剂研究提供质量标准参考。1材料1.1主要仪器本研究的主要仪器有Dionex UltiMate 3000型HPLC仪[配DGP-3600SD型泵、TCC-3000RS型柱温箱、二极管阵列检测器、Chromeleon色谱工作站（美国Thermo Fisher Scientific公司）]，CP225D型十万分之一电子天平、BS224S型万分之一电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）等。1.2主要药材与试剂健脾化瘀方中各单味饮片的来源信息见表1，经广东省人民医院中医内科王昌俊教授鉴定均为真品，且符合2020年版《中国药典》相关项下规定，10批健脾化瘀方样品由上述饮片随机组合而成。对照品对香豆酸（批号DSTDD005701，纯度≥98%）、佛手柑内酯（批号OK20221215F，纯度≥98%）、橙皮苷（批号DST220704-038，纯度≥98%）、阿魏酸（批号DSTDF008102，纯度≥98%）、槲皮素（批号DSTDH002802，纯度≥98%）、苦参碱（批号OK20221212K，纯度≥98%）均购自成都德思特生物技术有限公司；绿原酸对照品（批号Y20A11K111541，纯度≥98%）购自上海源叶生物科技有限公司；香草酸对照品（批号BCBS1036V，纯度≥98%）购自美国Sigma-Aldrich公司；对照药材莪术（批号120973-202205）、白花蛇舌草（批号121183-201605）、苦参（批号121019-201708）、白术（批号120925-202114）、茯苓（批号121117-201910）、佛手（批号120933-201706）均购自中国食品药品检定研究院；甲醇为色谱纯（美国BCR有限公司），其他试剂均为分析纯，水为超纯水。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.23.10.T001表110批健脾化瘀方中各单味饮片的来源信息编号莪术白花蛇舌草苦参白术茯苓佛手产地批号产地批号产地批号产地批号产地批号产地批号S1广西221001湖南220801广西220801浙江221102安徽221202广东220901S2广西220601湖南221102广西220601福建220901安徽230102广西2112004S3四川23010102湖南221101河北2212004安徽22120201湖南230402921广东230101S4广西221201江西22122512广西HX22F01浙江HX23R02浙江221201广东220816S5广西230101湖南221001山西230500661浙江230460291湖北YP22G01四川230401031S6广西230303831江苏230408010山西230303981湖南230460071安徽YP22H01浙江YPB3D0001S7江西YP22L01江西230401451河南2021061507安徽230301安徽230301广东2302164S8云南201201广东YP22J01内蒙古220201浙江YP23C01云南230405重庆230301S9广西220501湖南221201广西221201云南230501安徽230201广东220801S10福建23012944河南230101广西YP22I01安徽20230212安徽GX221209四川2212027012方法与结果2.1色谱条件色谱柱为Thermo Hypersil Gold C18（250 mm×4.6 mm，5 µm）；流动相为甲醇（A）-0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～10 min，5%A；10～15 min，5%A→12%A；15～30 min，12%A→29%A；30～41 min，29%A；41～80 min，29%A→88%A；80～90 min，88%A；90～92 min，88%A→5%A；92～102 min，5%A）；苦参碱的检测波长为211 nm，其他成分的检测波长为283 nm；流速为1.0 mL/min；柱温为30 ℃；进样量为5 μL。2.2溶液的制备2.2.1健脾化瘀方样品浓缩液的制备健脾化瘀方由白术12 g、莪术12 g、佛手12 g、茯苓20 g、苦参20 g、白花蛇舌草20 g组成。按组方配比分别称取白术、莪术、佛手饮片各6 g，茯苓、苦参、白花蛇舌草饮片各10 g。先用挥发油提取器提取白术、莪术、佛手的挥发油，备用；其药渣与上述称好的茯苓、苦参、白花蛇舌草混合，以1∶10的料液比加水浸泡30 min，提取3次，每次1.5 h，合并提取液，滤过、减压浓缩，再与挥发油混合后定容至100 mL容量瓶中，得健脾化瘀方样品浓缩液。2.2.2健脾化瘀方供试品溶液的制备精密吸取健脾化瘀方样品浓缩液1.5 mL，置2 mL容量瓶中，以水定容，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。2.2.3对照品溶液的制备分别精密称取绿原酸、香草酸、对香豆酸、阿魏酸、橙皮苷、槲皮素、佛手柑内酯、苦参碱对照品0.820 0、1.980 0、9.990 0、10.040 0、1.166 0、10.040 0、9.980 0、10.130 0 mg，加甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，得上述8种成分质量浓度依次为0.082 0、0.198 0、0.999 0、1.004 0、0.116 6、1.004 0、0.998 0、1.013 0 mg/mL的单一对照品溶液；分别精密移取绿原酸、香草酸、对香豆酸、阿魏酸、橙皮苷、槲皮素、佛手柑内酯单一对照品溶液适量，用甲醇稀释并定容至同一5 mL容量瓶中，得上述7种成分质量浓度分别为0.020 5、0.039 6、0.059 9、0.020 1、0.023 3、0.020 1、0.020 0 mg/mL的混合对照品溶液。2.2.4对照药材溶液的制备按处方比例，分别称取白花蛇舌草、茯苓、苦参对照药材适量，分别以1∶10的料液比加水浸泡30 min，提取3次，每次1.5 h，合并提取液，滤过、减压浓缩，并定容至100 mL容量瓶中，即得对照药材浓缩液。分别精密移取上述3种对照药材浓缩液1.0 mL至2 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得白花蛇舌草、茯苓、苦参的对照药材溶液。按处方比例，分别称取白术、莪术、佛手对照药材适量，先用挥发油提取器提取挥发油，备用；药渣再分别以1∶10的料液比加水浸泡30 min，提取3次，每次1.5 h，合并提取液，滤过、减压浓缩；将所得挥发油与相应对照药材的浓缩液混合，并定容至100 mL容量瓶中，即得对照药材浓缩液。分别精密移取上述3种对照药材浓缩液1.0 mL至2 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得白术、莪术、佛手的对照药材溶液。2.2.5阴性供试品溶液的制备按处方比例和“2.2.1”“2.2.2”项下方法，分别制备缺白花蛇舌草及白术（不含绿原酸和香草酸），缺白花蛇舌草、佛手及莪术（不含对香豆酸和阿魏酸），缺佛手（不含橙皮苷），缺白花蛇舌草、佛手及苦参（不含槲皮素和佛手柑内酯），缺苦参（不含苦参碱）的阴性供试品溶液。2.3指纹图谱研究2.3.1精密度试验取健脾化瘀方样品浓缩液（编号S1），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，以12号对香豆酸色谱峰为参照峰（S），计算得到各共有峰相对保留时间的RSD为0.01%～0.70%（n＝6），相对峰面积的RSD为0.21%～2.26%（n＝6），表明该方法精密度良好。2.3.2重复性试验取健脾化瘀方样品浓缩液（编号S1），按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，以12号对香豆酸色谱峰为参照峰（S），计算得到各共有峰相对保留时间的RSD为0.01%～0.29%（n＝6），相对峰面积的RSD为0.33%～2.11%（n＝6），表明该方法重复性良好。2.3.3稳定性试验取健脾化瘀方样品浓缩液（编号S1），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别于制备后0、3、6、9、12、24 h按“2.1”项下色谱条件进样测定，以12号对香豆酸色谱峰为参照峰（S），计算得到各共有峰相对保留时间的RSD为0.01%～0.30%（n＝6），相对峰面积的RSD为0.20%～2.41%（n＝6），表明供试品溶液在24 h内稳定性较好。2.3.4指纹图谱的建立及相似度评价取10批健脾化瘀方供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，将数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》，以编号S1样品的色谱图为参照图谱，采用平均数法，时间窗设为0.2 min，进行多点校正、全谱峰匹配，建立样品（编号S1～S10）叠加指纹图谱及对照指纹图谱（R），共确定了27个共有峰，详见图1；通过与混合对照品溶液色谱图（图2）比对，指认出7个成分，分别为8号绿原酸、9号香草酸、12号对香豆酸、15号阿魏酸、19号橙皮苷、22号槲皮素、24号佛手柑内酯。以《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012版）》计算相似度，可得10批样品与对照指纹图谱的相似度为0.942～0.999。此外，在211 nm检测波长下，通过苦参碱对照品溶液色谱图指认出健脾化瘀方中的苦参碱成分，详见图3。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.23.10.F001图110批健脾化瘀方的HPLC叠加指纹图谱及对照指纹图谱10.6039/j.issn.1001-0408.2023.23.10.F002图2健脾化瘀方供试品溶液与混合对照品溶液的HPLC图8：绿原酸；9：香草酸；12：对香豆酸；15：阿魏酸；19：橙皮苷；22：槲皮素；24：佛手柑内酯；a：混合对照品溶液；b：健脾化瘀方供试品溶液（编号S1）。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.23.10.F003图3健脾化瘀方供试品溶液在211 nm波长下的HPLC图a：健脾化瘀方供试品溶液（编号S1）；b：苦参碱对照品溶液。2.3.5色谱峰归属将白术、莪术、茯苓、佛手、苦参、白花蛇舌草对照药材溶液，健脾化瘀方供试品溶液（编号S1）与混合对照品溶液的HPLC图进行比对，以确定共有峰来源。结果发现，峰1、2、4、6、8、9、10、11归属于白术药材，峰7、12、15、20、21、25归属于莪术药材，峰1、27归属于茯苓药材，峰1、2、4、12、13、15、19、22、24归属于佛手药材，峰1、2、3、4、5、7、11、13、16、18、20、21、22、23、24、27归属于苦参药材，峰1、4、7、8、9、10、11、12、14、15、17、22、23、24、26归属于白花蛇舌草药材，详见图4。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.23.10.F004图4健脾化瘀方供试品、混合对照品及各对照药材溶液的HPLC图a：健脾化瘀方供试品溶液（编号S1）；b：混合对照品溶液；c：茯苓对照药材溶液；d：白术对照药材溶液；e：苦参对照药材溶液；f：莪术对照药材溶液；g：白花蛇舌草对照药材溶液；h：佛手对照药材溶液。分别取健脾化瘀方供试品溶液（编号S1）、混合对照品溶液及各阴性供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，得绿原酸、香草酸、对香豆酸、阿魏酸、橙皮苷、槲皮素、佛手柑内酯、苦参碱的阴性对照图谱，详见图5、图6。根据图5、图6，可确定绿原酸（峰8）和香草酸（峰9）来自白花蛇舌草和白术；对香豆酸（峰12）和阿魏酸（峰15）来自白花蛇舌草、佛手和莪术；橙皮苷（峰19）来自佛手；槲皮素（峰22）和佛手柑内酯（峰24）来自白花蛇舌草、佛手和苦参；苦参碱来自苦参。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.23.10.F005图5健脾化瘀方供试品、混合对照品及部分阴性供试品溶液的HPLC图a：缺白花蛇舌草、佛手、莪术的阴性供试品溶液；b：缺白花蛇舌草、白术的阴性供试品溶液；c：缺白花蛇舌草、佛手、苦参的阴性供试品溶液；d：缺佛手的阴性供试品溶液；e：混合对照品溶液；f：健脾化瘀方供试品溶液（编号S1）。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.23.10.F006图6健脾化瘀方供试品、苦参碱对照品及缺苦参阴性供试品溶液的HPLC图a：缺苦参的阴性供试品溶液；b：健脾化瘀方供试品溶液（编号S1）；c：苦参碱对照品溶液。2.4含量测定2.4.1线性关系考察取“2.2.3”项下混合对照品溶液和苦参碱对照品溶液各适量，分别用甲醇稀释成系列质量浓度的溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，以对照品实际进样量（μg）为横坐标（x）、峰面积为纵坐标（y），进行线性回归分析，结果见表2。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.23.10.T002表2健脾化瘀方中8种成分的线性关系考察结果成分回归方程r线性范围/μg绿原酸y＝28.445x－0.572 70.999 60.020～0.615香草酸y＝19.030x－0.181 70.999 60.040～1.188对香豆酸y＝97.909x－0.789 30.999 70.060～1.798阿魏酸y＝56.184x－0.419 20.999 60.020～0.603橙皮苷y＝31.112x+0.051 90.999 80.023～0.700槲皮素y＝34.224x－0.128 20.999 90.020～0.602佛手柑内酯y＝20.584x+0.003 50.999 80.020～0.599苦参碱y＝1.440x+34.216 00.999 55.065～40.522.4.2精密度试验取“2.2.3”项下混合对照品溶液和苦参碱对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别连续进样测定6次，记录峰面积。结果显示，绿原酸、香草酸、对香豆酸、阿魏酸、橙皮苷、槲皮素、佛手柑内酯、苦参碱峰面积的RSD分别为0.85%、1.43%、1.03%、1.02%、1.08%、1.72%、0.66%、0.36%（n＝6），表明仪器精密度良好。2.4.3重复性试验取健脾化瘀方样品浓缩液（编号S1），按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，以外标法计算样品含量。结果显示，绿原酸、香草酸、对香豆酸、阿魏酸、橙皮苷、槲皮素、佛手柑内酯、苦参碱的平均含量分别为0.048、0.030、0.158、0.025、0.024、0.019、0.015、14.00 mg/g，RSD分别为0.59%、0.39%、1.81%、1.36%、2.21%、2.01%、1.14%、1.18%（n＝6），表明该方法重复性良好。2.4.4稳定性试验取健脾化瘀方样品浓缩液（编号S1），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别在0、3、6、9、12、24 h进样测定，记录峰面积。结果显示，绿原酸、香草酸、对香豆酸、阿魏酸、橙皮苷、槲皮素、佛手柑内酯、苦参碱峰面积的RSD分别为0.88%、0.92%、0.50%、1.93%、0.40%、1.15%、1.17%、1.34%（n＝6），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。2.4.5加样回收率试验取已知成分含量的健脾化瘀方样品浓缩液（编号S1），共6份，每份精密移取0.75 mL，按1∶1（m/m）加入各单一对照品溶液，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算加样回收率。结果显示，绿原酸、香草酸、对香豆酸、阿魏酸、橙皮苷、槲皮素、佛手柑内酯、苦参碱的平均加样回收率分别为99.48%、101.32%、101.18%、100.79%、101.12%、99.19%、99.81%、102.46%，RSD分别为1.34%、0.93%、1.90%、1.84%、0.54%、1.53%、1.33%、1.01%（n＝6），表明该方法准确度良好。2.4.6样品含量测定按“2.2.1”项下方法制备10批健脾化瘀方样品浓缩液，再按“2.2.2”项下方法制备健脾化瘀方供试品溶液，然后按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录各成分的峰面积并按外标法计算样品中8种成分的含量。每批样品平行测定3次，取平均值，结果见表3。10.6039/j.issn.1001-0408.2023.23.10.T003表3不同批次健脾化瘀方中8种成分的含量测定结果（n＝3）编号绿原酸香草酸对香豆酸阿魏酸橙皮苷槲皮素佛手柑内酯苦参碱含量/（mg/g）RSD/%含量/（mg/g）RSD/%含量/（mg/g）RSD/%含量/（mg/g）RSD/%含量/（mg/g）RSD/%含量/（mg/g）RSD/%含量/（mg/g）RSD/%含量/（mg/g）RSD/%S10.0462.170.0301.950.1562.250.0252.430.0232.190.0192.890.0142.1714.050.71S20.0242.440.0252.280.1451.730.0302.000.0361.150.0172.110.0161.3014.901.34S30.0331.730.0301.950.1462.050.0281.790.0192.400.0231.390.0181.4018.102.76S40.0521.920.0272.110.1161.310.0062.530.0341.470.0251.010.0171.4816.191.91S50.0212.710.0282.040.1502.750.0292.470.0291.720.0232.280.0231.0923.191.12S60.0481.330.0342.520.1701.480.0311.860.0232.120.0211.920.0212.3821.271.50S70.0402.500.0281.230.1190.840.0221.710.0141.790.0261.170.0202.0123.000.87S80.0502.000.0321.410.1181.290.0242.500.0202.250.0192.640.0141.7924.111.29S90.0472.130.0281.610.1641.530.0272.780.0222.050.0241.050.0272.7814.901.34S100.0612.490.0281.790.2951.690.0621.210.0531.150.0191.320.0241.8818.292.023讨论3.1检测波长的确定笔者前期在选择检测波长时，取健脾化瘀方样品分别在203、225、246、283、310 nm波长下进行了扫描，通过观察各波长下的色谱峰数量、峰形以及响应程度，发现样品在283 nm波长下的色谱峰形状较好、易于观察，色谱峰数量相比在其他波长下更多，且基线比较稳定，故最后确定以283 nm作为检测波长。另外，苦参是健脾化瘀方治疗肝癌术后复发的起主要药效作用的中药之一，但其活性成分苦参碱在283 nm波长下的色谱峰响应低，故本研究根据相关文献报道[4]，选择211 nm作为检测波长单独对苦参碱进行了指纹图谱鉴定和含量测定。3.2流动相及洗脱条件的确定笔者前期分别以甲醇-甲酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.05%磷酸溶液作为流动相进行考察，结果显示以甲醇-0.05%磷酸溶液作为流动相进行梯度洗脱时，各色谱峰的基线更稳定、分离度更高，样品出峰数量更多。同时，通过对洗脱条件的不断优化，以调整成分出峰时间、提高色谱峰分离度，最后确定了文中的梯度洗脱条件。3.3指纹图谱结果分析本研究建立了健脾化瘀方的HPLC指纹图谱，通过方法学考察，可知其精密度、重复性、稳定性试验的RSD均小于3.00%，符合指纹图谱建立要求。该指纹图谱共确定了27个共有峰，指认了8个化学成分，根据相似度评价结果，10批样品与对照指纹图谱的相似度为0.942～0.999，表明10批健脾化瘀方供试品溶液的主要化学成分具有较高的一致性；但有部分批次样品之间的相似度低于0.900，如S4与S10、S7与S10、S8与S10间的相似度分别为0.865、0.896、0.855，表明不同产地、不同批次药材间的质量存在一定的差异。3.4含量测定结果分析中药的疗效与其活性成分、含量等有关。据文献报道，对香豆酸是白花蛇舌草的活性成分之一，它可通过促进肿瘤细胞凋亡、抑制其增殖与迁移以及抑制肿瘤血管生成而达到抗肿瘤的作用，并可进一步转化为绿原酸、阿魏酸[5]。橙皮苷可以较强地抑制各种类型的肿瘤细胞，改善肝、肾损伤[6]，是佛手的指标性成分。槲皮素和佛手柑内酯为白花蛇舌草、佛手及苦参共有的有效成分，其中槲皮素可抑制肿瘤细胞生长并诱导其凋亡，从而发挥抗肝癌等作用[7]；佛手柑内酯可通过磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路诱导人肝癌细胞HepG2和Hep3B凋亡[8]。香草酸是一种酚酸类化合物，为白花蛇舌草和白术共有的活性成分，可通过诱导细胞自噬来缓解棕榈酸诱导的HepG2细胞脂肪变性[9]。苦参碱为苦参的指标性成分，临床上常用于肝癌的治疗及预防复发[10]。上述成分的药理活性与健脾化瘀方的功能主治存在相关性。因此，为保障健脾化瘀方的质量和临床疗效，本研究在指纹图谱的基础上，采用HPLC法对上述化学成分进行了含量测定。结果显示，在“2.1”项下色谱条件下，供试品溶液中绿原酸、香草酸、对香豆酸、阿魏酸、橙皮苷、槲皮素、佛手柑内酯、苦参碱的色谱峰与其他组分色谱峰均能达到基线分离；其含量分别为0.021～0.061、0.025～0.034、0.116～0.295、0.006～0.062、0.014～0.053、0.017～0.026、0.014～0.027、14.05～24.11 mg/g。10批样品中化学成分的含量存在差异，可能与药材的不同产地、不同批次有关。综上所述，本研究所建立的指纹图谱和含量测定方法可为健脾化瘀方的质量控制以及后续的制剂开发提供参考依据。