健脾化浊调脂颗粒（Jianpi huazhuo tiaozhi granules，JHTG）是江西中医药大学附属医院刘中勇教授在“浊邪致病”“从浊论治”的基础上，根据“胸痹心痛”“本虚标实”的病理特点及多年临床经验所创立的可用于治疗动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）的经验方。该方以党参、荷叶为君药，茯苓、丹参、白术、木香、陈皮为臣药，佐以薏苡仁、丝瓜络、山楂、砂仁、泽泻、麦芽，以达到健脾益气、祛湿化浊之功。虽然本课题组前期研究证实了JHTG的临床疗效及其抗AS的作用[1―2]，但中药复方化学成分复杂，入血后各成分的变化情况及发挥药效的物质基础并不明确，不利于揭示JHTG治疗AS的内在作用机制。血清药物化学方法是通过检测血清中的化学物质来分析外源性活性物质及其作用和代谢规律的新方法，在中药及其复方的药效物质基础研究领域应用广泛[3]。超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）技术能够快速准确地检测和定量分析复杂化合物。基于此，本研究借助血清药物化学方法，以UPLC-MS/MS技术为检测手段，对JHTG的化学成分及入血成分（含原型成分及代谢产物）进行分析，以期为该方药效物质基础的阐释及院内制剂的进一步开发提供实验依据。1材料1.1主要仪器本研究所用主要仪器包括Synapt G2-Si型质谱仪、ACQUITY UPLC Ⅰ Class system型液相色谱系统（美国Waters公司），XSE205DR型电子天平（瑞士Mettler Toledo公司），Vortex-2 Genie型涡旋混合器（美国Scientific Industries公司），5810R型低温离心机（德国Eppendorf公司），WD-9415C型超声波清洗器（北京六一生物科技有限公司），Milli-Q 型超纯水净化系统（美国Millipore公司）等。1.2主要药品与试剂JHTG[专利号ZL2015104300758，批号20221011，规格为每袋10 g（相当于原药材23.54 g）]由江西中医药大学附属医院提供；茯苓酸、白术内酯Ⅱ、泽泻醇A、泽泻醇B、土木香内酯、乙酸龙脑酯、丹酚酸A、丹酚酸C对照品（批号分别为MUST-23071117、MUST-22111604、MUST-22110115、MUST-23060414、MUST-23053107、MUST-23062702、MUST-23032107、MUST-23071312，纯度均不低于98%）均购自成都曼思特生物科技有限公司；乙腈、甲醇、甲酸均为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为去离子水。1.3实验动物健康SPF级雄性SD大鼠12只，体重（200±20）g，由江西中医药大学提供，动物生产许可证号为SCXK（赣）2022-0001。所有大鼠均饲养于室温（22±2）℃、相对湿度（55±15）%、每12 h明暗交替的环境中，自由摄食、饮水，适应性喂养1周后开始实验。本实验方案经江西中医药大学实验动物伦理委员会审查通过（批准文号JZLLSC20230748）。2方法2.1供试品溶液的制备称取JHTG 100 mg，置于15 mL离心管内，加50%甲醇10 mL，超声30 min，取上清液1 mL置于离心管中，以14 000 r/min离心5 min，取上清液，经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。2.2对照品溶液的制备分别称取“1.2”项下各对照品适量，加50%甲醇溶解，制成质量浓度均为0.1 mg/mL的混合对照品储备液；精密量取上述混合对照品储备液1 mL，以50%甲醇稀释，制成质量浓度均为20 μg/mL的混合对照品溶液，经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。2.3灌胃药液的制备取JHTG适量，以水为溶剂，制成质量浓度为0.7 g/mL的药液。上述质量浓度参照JHTG成人临床常用日剂量并按大鼠体表面积折算而得。2.4样本采集与处理将12只SD大鼠随机分为空白组和给药组，每组6只。禁食、不禁水12 h后，给药组大鼠灌胃JHTG药液3 mL，空白组大鼠灌胃等体积生理盐水。灌胃60 min后，于大鼠眼内眦静脉丛取血0.5 mL，室温下静置2 h后，于4 ℃下以3 000 r/min离心10 min，取上层血清，于－80 ℃下冻存，备用。取同组大鼠的血清样品，等体积混合以消除个体差异。取空白组大鼠血清样品（即空白血清样品）和给药组大鼠血清样品（即含药血清样品）各100 μL，加乙腈500 μL，涡旋混匀2 min后，再以14 000 r/min离心5 min，取上清液500 μL，置于进样瓶中，备检。2.5色谱与质谱条件以Waters ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）为色谱柱，以0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈溶液（B）为流动相进行梯度洗脱（0～15 min，100%A；15～50 min，100%A→80%A；50～60 min，80%A→100%B；60～70 min，100%B→100%A）；流速为0.25 mL/min；柱温为35 ℃；进样量为10 μL。在电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI）正、负离子模式下进行扫描，质量扫描范围为50～1 500 Da；毛细管电压为3 kV（正离子模式）、2.5 kV（负离子模式）；锥孔电压为40 V；碰撞能为10～50 eV；离子源温度为125 ℃；脱溶剂温度为500 ℃；锥孔气流速为50 L/h，脱溶剂气流速为800 L/h；分析时间为80 min。2.6数据处理采用UPLC Ⅰ Class和Synapt G2-Si Qtof软件进行JHTG化学成分的色谱分离和质谱数据采集，结合UNIFI天然产物整体解决方案，基于6400天然产物理论质谱数据库对成分进行数据处理。由于JHTG所含化学成分众多，本研究通过查阅国内外文献，整理各味药材所含化学成分的基本信息（分子式、结构式、精确分子量等），再依据二级质谱裂解规律，并比对“2.2”项下混合对照品的色谱、质谱信息，对JHTG的化学成分及入血成分进行结构分析、确认。3结果3.1JHTG的总离子流图取“2.1”项下供试品溶液、“2.2”项下混合对照品溶液和“2.4”项下2组大鼠的血清样品，按“2.5”项下检测条件进样分析，采集正、负离子模式下的色谱信息，得相应总离子流图（total ion chromatogram，TIC），详见图1、图2。10.6039/j.issn.1001-0408.2024.02.03.F001图1JHTG供试品溶液、空白血清、含药血清和混合对照品溶液的TIC（正离子模式）10.6039/j.issn.1001-0408.2024.02.03.F002图2JHTG供试品溶液、空白血清、含药血清和混合对照品溶液的TIC（负离子模式）3.2JHTG化学成分分析本研究从JHTG供试品溶液中共鉴定出130个成分，其中党参3个、荷叶13个、茯苓15个、白术5个、陈皮9个、薏苡仁1个、泽泻19个、丹参24个、麦芽7个、山楂24个、砂仁2个、木香3个；另有待确认成分5个，其中槲皮素、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、山柰黄素、柠檬酸可能来源于荷叶或山楂，土当归酸可能来源于茯苓或山楂。在这130个成分中，有8个成分经与对照品比对后得到进一步确认，分别为茯苓酸、白术内酯Ⅱ、泽泻醇A、泽泻醇B、土木香内酯、乙酸龙脑酯、丹酚酸A、丹酚酸C。结果见表1。10.6039/j.issn.1001-0408.2024.02.03.T001表1JHTG化学成分及入血原型成分分析结果药材成分数成分名称（加合离子）党参3党参苷Ⅱ（+Na）a、补骨脂内酯（+H）、苜蓿素（－H）荷叶13荷叶碱（+H）、异槲皮苷（－H）、D-儿茶素（－H）、亚美罂粟碱（+H）a、N-甲基异衡州乌药碱（+H）、槲皮素-3-O-β-D-吡喃木糖（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷（－H）、N-甲基衡州乌药碱（+H）、O-去甲基荷叶碱（+H）、柯伊利素-7-O-β-D-葡萄糖苷（+H）a、番荔枝碱（+H）、异鼠李素（+H）a、杨梅素-3-葡萄糖苷（－H）、去甲乌药碱（－H）茯苓15茯苓新酸F（－H）a、茯苓新酸B（－H）、茯苓酸（－H）a、茯苓新酸DM（+H）a、茯苓新酸AM（+H）a、3-表-去氢茯苓酸（－H）a、16-氧乙酰茯苓酸甲酯（+Na）a、3-表-去氢土莫酸（－H）a、土莫酸（+Na）、氢化松苓酸（+Na）、3β，16α-二羟基羊毛甾-8，24-二烯-21-酸（－H）a、3β-乙酰氧基-16α-羟基羊毛甾-8，24-二烯-21-酸（－H）、茯苓新酸E（－H）、去氢茯苓酸（－H）、去氢土莫酸（－H）a白术53β-乙酰氧基苍术酮（+H）a、白术内酯Ⅱ（－H）a、苍术烯内酯甲（－H）a、双白术内酯（+H）a、白术内酯Ⅲ（－H）a陈皮9川陈皮素（+H）a、甜橙素（+H）a、福橘素（+H）a、橙皮苷（－H）、橙皮素（+H）、3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黄酮（+H）a、柚皮黄素（+Na）a、新橙皮苷（+H）a、柚皮素（－H）a薏苡仁1α-单亚麻酯（+H）a泽泻1925-脱水-24-乙酰泽泻醇A（+Na）a、泽泻磺醇C（+H）a、泽泻醇C（－H）a、16-羰基泽泻醇A（+H）a、13，17-环氧泽泻醇A（+Na）a、泽泻醇A（+Na）a、11-去氧-23-乙酰泽泻醇B（+Na和+H）a、泽泻磺醇A（+H）、泽泻醇Ⅰ（+H）、泽泻萜醇F（+Na）、泽泻二萜醇（+H）a、泽泻磺醇D（+Na）、泽泻醇F（－H）a、泽泻醇B（－H）、13，17-环氧泽泻醇B（－H）a、泽泻二醇（－H）a、泽泻二萜苷（－H）、23-乙酰泽泻醇J（+H）a、新泽泻醇A（－H）a丹参24丹酚酸E（－H）a、丹酚酸A（－H）a、紫草酸B（－H）a、丹酚酸G（－H）、迷迭香酸（－H）、丹酚酸D（－H）、紫草酸（－H）、丹酚酸C（－H）、丹参素（－H）a、丹酚酸F（+H）a、丹参新醌丁（+H）a、丹参酚醌Ⅰ（－H）a、1，2-二氢丹参酮Ⅰ（+H）a、羟基丹参酮ⅡA（+H）a、次甲丹参醌（+H）、黄芩苷（－H）a、丹参酮ⅡB（－H）a、紫草酸单甲酯（－H）、3-羟基-4-甲氧基肉桂酸（－H）a、异欧前胡内酯（－H）、丹参酸甲酯（+Na和+H）a、原儿茶醛（－H）、迷迭香酸甲酯（+H）、左旋二氢丹参 酮Ⅰ（+H）a麦芽7天师酸（－H）a、禾草碱（+H）、麦黄苷（－H）a、（E，E）-9-酮-10，12-十八碳二烯酸（+Na）a、肥皂草苷（－H）、杜鹃花酸（－H）、豆甾-5-烯-3β-醇-7-酮（+Na）a山楂245-羟基酸橙素（+H）a、奎尼酸（－H）、2-羟基-丁二酸（－H）、异红蓼素（－H）、红蓼素（－H）、对羟基苯甲苹果酸（－H）a、3，4-二羟基桂皮酸（－H）a、山楂苷Ⅰ（+Na）、山梨醇（－H）、绿原酸（－H）、散亭（+H）、对羟基苯甲酸（－H）、山楂苷B（+H）、丙酮酸（－H）、富马酸（－H）、熊果酸（－H）、科罗索酸（－H）a、牡荆苷（+H）a、十八碳酸（－H）、阿魏酸（－H）a、3，5-O-二甲基-没食子酸（－H）a、反油酸（－H）、马斯里酸（－H）、罂酸（－H）a砂仁2香草酸-β-D-吡喃葡萄糖酯（－H）a、乙酸龙脑酯（－H）a木香3α-香附酮（+Na）a、土木香内酯（－H）a、土荆芥内酯（+H）a待确认5槲皮素（+H）ab、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（+Na和+H）b、山柰黄素（－H）ab、柠檬酸 （－H）b、土当归酸（－H）ca：入血原型成分；b：可能存在于荷叶或山楂中；c：可能存在于茯苓或山楂中。3.3JHTG入血原型成分分析对比JHTG供试品溶液和含药血清样品的色谱数据，将同时存在于上述2种样品中的成分判定为入血原型成分。本研究结合“3.2”项下JHTG化学成分分析结果，参照二级质谱裂解规律，初步鉴定了大鼠口服JHTG后血清中的72个入血原型成分，其中党参1个、荷叶3个、茯苓9个、白术5个、陈皮7个、薏苡仁1个、泽泻13个、丹参14个、麦芽4个、山楂8个、砂仁2个、木香3个，以黄酮类、萜类、木脂素类、酚酸类、有机酸类、香豆素类成分为主；另有待确认成分2个，槲皮素、山柰黄素可能存在于荷叶或山楂中。结果见表1。3.4JHTG入血代谢产物分析对比JHTG含药血清样品和空白血清样品的色谱数据，将在含药血清样品中存在而在空白血清样品中不存在的非原型成分判定为代谢产物。本研究结合药物在体内可能存在的代谢途径并结合相关文献[4―12]，共鉴定出11个代谢产物，多为萜类成分。结果见表2。10.6039/j.issn.1001-0408.2024.02.03.T002表2JHTG入血后血清中主要代谢产物分析结果代谢产物名称分子式理论分子量分子离子峰m/z质量偏差/ppm保留时间/min加合离子来源去氢番荔枝碱C17H13NO2263.094 6264.099 0－10.822.06+H荷叶16-氧乙酰茯苓酸C35H54O6570.392 0569.384 67.970.18－H茯苓茯苓新酸DC31H46O6514.329 4515.337 41.266.73+H茯苓25-羟基-3-差向-去氢土莫酸C31H48O5500.350 2501.354 4－6.165.55+H茯苓苍术酮C15H20O216.151 4217.161 914.660.80+H白术3β-羟基苍术酮C15H20O2232.146 3233.156 813.843.81+H白术24-乙酰泽泻醇FC32H50O6530.360 7531.375 614.377.00+H泽泻16β-甲氧基-23-乙酰泽泻醇BC33H52O6544.376 4545.386 04.276.93+H泽泻10-甲氧基-泽泻二醇C16H28O2252.208 9251.203 46.848.30－H泽泻11-去氧-13β，17β-环氧泽泻醇AC30H50O5490.365 8489.357 5－2.249.36－H泽泻丹参酮ⅡAC19H18O3294.125 6295.135 48.546.05+H丹参上述成分在体内主要发生加氧、脱氢、脱羟基等Ⅰ相代谢反应及甲基化、乙酰化等Ⅱ相代谢反应。本研究以去氢番荔枝碱、16-氧乙酰茯苓酸和10-甲氧基-泽泻二醇为例，对JHTG代谢产物的裂解途径进行说明：番荔枝碱是荷叶中阿朴啡类生物碱成分，具有m/z 266.117 3[M+H]+的准分子离子峰。本研究从JHTG含药血清样品中检出了m/z 264.099 0[M+H]+的准分子离子峰及丰度较强的m/z 280.073 0二级碎片离子峰，这可能与番荔枝碱环烃上的氢发生氧化，再与邻近的氢发生反应脱去1分子H2O有关。根据成分裂解规律并参照PubChem数据库收录的质谱信息，推测该代谢产物可能为去氢番荔枝碱。茯苓酸是茯苓的主要化学成分，具有m/z 527.371 9[M－H]－的准分子离子峰。本研究从JHTG含药血清样品中检出了m/z 569.384 6[M－H]－的准分子离子峰，以及与茯苓酸碎片离子峰相一致的m/z 339.200 3、325.187 2[M－H]－二级碎片离子峰。根据成分裂解规律并参照茯苓酸的质谱信息[5―6]，推测该代谢产物可能是茯苓酸经乙酰化反应后生成的16-氧乙酰茯苓酸。泽泻二醇是泽泻的主要化学成分，具有m/z 237.188 2[M－H]－的准分子离子峰及m/z 96.965 1[M－H]－的碎片离子峰。本研究从JHTG含药血清样品中检出了m/z 251.203 4[M－H]－的准分子离子峰及m/z 237.093 6、96.171 7、78.958 4[M－H]－的二级碎片离子峰。根据成分裂解规律并参照茯苓酸的质谱信息[7―8]，推测该代谢产物可能是泽泻二醇母核侧链羟基上的氢被甲基化后生成的10-甲氧基-泽泻二醇。4讨论AS的发病机制主要涉及炎症反应、内皮损伤、脂质浸润等方面，JHTG的入血成分及其代谢产物如黄酮类、萜类、木脂素类、生物碱类等成分，大多具有抗炎、抗氧化、降血脂等抗AS作用[13―14]。本研究运用UPLC-MS/MS技术对JHTG的化学成分及入血成分进行分析，结合已有文献和对照品共鉴定出130个化学成分和83个入血成分，后者包含72个入血原型成分和11个代谢产物，代谢途径主要包括Ⅰ相代谢反应（脱氢及加氧等反应）及Ⅱ相代谢反应（甲基化及乙酰化等反应）。相关研究表明，茯苓酸可通过抑制胞外信号调节激酶1/2和p38丝裂原激活的蛋白激酶通路来降低肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素1（interleukin-1，IL-1）、IL-6水平，从而发挥抗炎作用[15]；苍术酮能调控炎症通路，降低一氧化氮、IL-6、TNF-α等炎症因子水平及环氧合酶2、诱导型一氧化氮合酶等蛋白的表达，从而发挥抗炎作用[16]；23-乙酰泽泻醇B可通过促进雌激素受体α来抑制蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin-9的合成和分泌，或通过抑制3-羟基-3甲基戊二酸辅酶A还原酶的活性来降低胆固醇的积累，从而起到调节血脂的作用[17―18]。可见，这些入血成分可能是JHTG潜在或直接发挥相应药理作用的活性成分。综上所述，本研究鉴定了JHTG的化学成分及经大鼠口服后的入血成分，初步探讨了该方的药效物质基础，所得结果可为JHTG药效作用靶点、代谢机制的研究及院内制剂的开发提供依据。