肠易激综合征（irritable bowel syndrome，IBS）是一种无器质性疾病的功能性肠病，以腹痛或腹部不适伴排便习惯改变为特征，最常见的是腹泻型IBS（diarrhea-type irritable bowel syndrome，IBS-D）[1]。IBS的发病机制尚不完全清楚，目前认为IBS是胃肠动力异常、内脏感觉异常、脑-肠调节异常、炎症等多种因素共同作用的结果[2]。相关研究表明，肠道菌群失衡和有害细菌定植增加是IBS-D患者重要的发病机制和临床表现之一，也被认为是IBS-D患者内脏敏感性升高的原因[3]。也有研究表明，肠道菌群代谢产物短链脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）、胆汁酸等的变化可能参与了IBS的发病过程[4]。5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）是脑-肠轴的关键神经递质和信号分子，90%～95%的5-HT由肠道产生，其中大部分由肠嗜铬细胞释放[5]。5-HT通过与多种5-HT受体结合发挥其生物学效应，其中5-HT3受体（5-HT3R）和5-HT4受体（5-HT4R）与IBS的发病机制密切相关[6]；同时，5-HT作用的强度和持续时间最终取决于5-HT失活的效率，由于细胞间降解酶相对缺乏，5-HT信号传导的终止几乎完全依赖于固有层中5-HT转运体（5-HT transporter，SERT），因为5-HT的再摄取主要由SERT将5-HT转运至细胞内，进而在细胞内被降解，其代谢产物则通过肾脏排出体外[7]。P物质（SP）是中枢神经系统的一种兴奋性神经递质，对肠道动力和敏感性有调节作用[8]。可见，5-HT和SP等物质介导的脑-肠轴对调节IBS肠道菌群具有重要作用。中医治疗的方针是有机整体观念和辨证论治。组学技术能够从整体角度反映多因素作用下的器官功能和代谢状态，现已成为中药作用机制研究的有力工具。已有研究证实，生白术能有效改善便秘症状；木香性温，味辛、苦，具有行气调中、止痛、健脾的功效[9]。课题组前期研究也证实，香砂六君子汤中药效物质基础可能来源于白术、木香，可有效改善脾虚IBS-D模型大鼠的肠动力[10]。基于此，本研究根据香砂六君子汤原方中白术和木香的比例制备白术-木香药对水煎液，用其干预脾虚IBS-D模型大鼠，并基于5-HT和SP等物质介导的脑-肠轴，探讨白术-木香药对对该模型大鼠肠道菌群与SCFAs代谢的调节作用，以期为脾虚IBS-D的治疗提供参考。1材料1.1主要仪器本研究所用主要仪器有Thermo Trace 1300型气相系统、Thermo ISQ 7000型质谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司），FLx800型酶标仪（美国BioTek公司），MiSeq型测序仪（美国Illumina公司），BA210 Digital型数码三目摄像显微镜（麦克奥迪实业集团有限公司），JY-SCZ4+型垂直电泳槽（北京君意东方电泳设备有限公司），5200 Multi型荧光图像分析系统（上海天能生命科学有限公司）。1.2主要药品与试剂白术、木香、番泻叶药材均来自贵州中医药大学第二附属医院药剂科，经该科室主任中药师赵海鉴定为真品。匹维溴铵（批号32208002）购自北京福元医药股份有限公司；RIPA组织裂解液（批号P0013）购自上海碧云天生物技术有限公司；兔源5-HT3R、5-HT4R单克隆抗体（批号分别为BS-24700R、BS-12054R）均购自北京博奥森生物技术有限公司；兔源SERT、β-actin单克隆抗体（批号分别为A19110、AC026）均购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；5-HT、SP酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（批号分别为ZC-35959、ZC-36170）均购自上海茁彩生物科技有限公司；乙醚（纯度≥99.5%）购自成都市科隆化学品有限公司；乙酸（纯度≥99%）、丙酸标准品（纯度≥99.5%）均购自美国Sigma公司；丁酸标准品（纯度≥99%）购自东京化成工业株式会社；其余试剂为实验室常用规格，水为超纯水。1.3实验动物本研究所用动物为SD大鼠，6周龄，体重为（200±20） g，雌雄各半，购自成都达硕实验动物有限公司，动物生产许可证号为SCXK（川）2020-030。大鼠饲养环境温度为（25±2） ℃，相对湿度为50%～60%，自由饮食。本实验经贵州中医药大学动物伦理委员会审批通过（批准号为20220104），动物使用许可证号为SYXK（黔）2021-0005。2方法2.1药液的制备2.1.1番泻叶水煎液称取番泻叶300 g，加水1 500 mL，浸泡2 h，武火煮沸，文火煎煮10 min；过滤，浓缩，即得质量浓度为1 g/mL的番泻叶水煎液（以生药量计）。2.1.2白术-木香药对水煎液根据香砂六君子汤原方中白术和木香的比例，称取白术12 g、木香4 g，先加入8倍量纯化水（mL/g，下同），以武火煮开后再以文火煎30 min，过滤，收集滤液；加入6倍量纯化水以武火煮开后再以文火煎煮20 min，过滤，收集滤液；合并2次滤液，在100 ℃水浴条件下进行浓缩，即得质量浓度为1.4 g/mL的白术-木香药对水煎液（以生药量计）。2.2分组、造模及给药参考相关文献方法进行造模[11]：给40只SD大鼠灌胃番泻叶水煎液，给药体积为10 mL/kg，每日2次，连续14 d。大鼠每次灌胃番泻叶水煎液后，采取弹力绷带束缚其两前肢和肩背部，限制其上半身活动，持续2 h；束缚期间联合给予夹尾刺激（用止血钳夹大鼠尾部，刺激其产生抓咬、怒叫、站立弓背等反应），每次夹尾3～5 min。14 d后观察大鼠，当其出现食少纳呆、泄泻严重甚至脱肛等主要症状，以及消瘦、体重减轻、神态萎靡、四肢不收、毛色枯槁、蜷缩聚堆、易疲劳中的2项次要症状时，表明脾虚IBS-D造模成功。取30只造模成功的大鼠，分为模型组和白术-木香药对低、中、高剂量组（0.7、1.4、2.8 g/kg，中剂量根据成人和大鼠的体表面积换算而得）以及阳性对照组（匹维溴铵1.5 mg/kg，剂量参考文献[12]设置），每组6只；另取6只健康大鼠作为空白对照组。空白对照组与模型组大鼠灌胃生理盐水，其余各组灌胃相应药液，每天1次，连续14 d。2.3大鼠一般状况观察及粪便含水量检测记录各组大鼠给药后1、7、14 d的体重，并观察其腹泻程度、精神状态及进食状况。收集大鼠粪便样本，经恒温加热干燥至恒重后，计算粪便含水量。粪便含水量＝（粪便干燥前质量－粪便干燥后质量）/粪便干燥前质量×100%。2.4大鼠肠道敏感性的检测末次给药后，参考文献[13]的方法对大鼠进行腹壁撤退反射（abdominal withdrawal reflex，AWR）阈值测量，即记录各组大鼠出现腹部抬起和背部弓起反应的最小注水量（mL），每只大鼠测量3次取平均值，时间间隔为30 s。AWR阈值越高，表明其肠道敏感性越低。2.5大鼠肠道推进率的检测末次给药后，大鼠禁食不禁水18 h，腹腔注射4%戊巴比妥钠进行麻醉，经腹主动脉采集血清样品后，取3只大鼠灌胃0.5 mL含5%黑色活性炭的半固体混悬液；30 min后处死，立即打开腹腔，分离肠系膜，截取从幽门至结肠末端的整段大小肠，直线平铺于白纸上，然后用直尺测量幽门至黑色活性炭前沿的距离以及至结肠末端的距离，并计算肠道推进率。肠道推进率＝幽门至黑色活性炭前沿的距离/幽门至结肠末端的距离×100%。肠道推进率检测结束后，收集各大鼠结肠组织、粪便样品，并将剩余3只大鼠处死，同法收集上述样品。2.6大鼠血清中5-HT、SP水平的检测取各组大鼠血清样品，按ELISA试剂盒说明书方法操作，检测大鼠血清中5-HT、SP水平。2.7大鼠结肠组织的病理学形态观察取3只大鼠结肠组织置于4%多聚甲醛中固定，制作石蜡切片，经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水合、苏木精-伊红染色、梯度乙醇脱水、二甲苯透明后，使用中性树胶封固，然后采用光学显微镜观察大鼠结肠组织的病理变化。2.8大鼠结肠组织中5-HT3R、5-HT4R、SERT蛋白表达水平的检测采用Western blot法检测。取各组大鼠结肠组织适量进行总蛋白提取，使用BCA试剂盒定量组织中的蛋白浓度后，变性失活，在凝胶电泳下分离，转膜；使用5%脱脂牛奶室温封闭2 h，加入5-HT3R、5-HT4R、SERT、β-actin一抗（稀释度均为1∶1 000）置于4 ℃下孵育过夜，然后加入相应二抗室温孵育2 h；以TBST洗涤3次，采用ECL系统对蛋白条带进行显色，以目的蛋白与内参β-actin的灰度值比值表示目的蛋白的表达水平。2.9大鼠粪便的16S rRNA测序取空白对照组、模型组和白术-木香药对高剂量组大鼠的粪便样本各适量，使用试剂盒对样本进行DNA提取与定量，扩增16S rRNA基因V3-V4区域，纯化回收，采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制备测序文库，进行高通量测序分析。将测序数据进行序列去噪或操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）聚类，选用Silva数据库（Release132版，http：//www.arb-silva.de）进行物种分类学注释，然后进行物种分析与α多样性分析。本研究以Chao1和observed species指数表征群落丰度，以Shannon和Simpson指数表征群落多样性，并制作相关图表。2.10大鼠粪便中SCFAs含量的检测取空白对照组、模型组和白术-木香药对高剂量组大鼠的粪便样本各适量，按照Han等[14]方法检测样本中乙酸、丙酸、丁酸的含量。2.11统计学方法所有数据采用SPSS 22.0软件进行分析，数据以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步组间两两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。3结果3.1白术-木香药对对模型大鼠一般状况及粪便含水量的影响与空白对照组比较，模型组大鼠给药7、14 d后的体重均显著降低（P＜0.01），粪便含水量显著升高（P＜0.01），同时出现严重腹泻、食欲减少、嗜睡、运动减少等症状；与模型组比较，各给药组大鼠给药7、14 d后的体重和粪便含水量（白术-木香药对低剂量组除外）均显著升高（P＜0.05或P＜0.01），腹泻缓解，精神状态恢复。结果见图1。10.6039/j.issn.1001-0408.2024.03.07.F001图1各组大鼠体重变化及粪便含水量检测结果（x±s，n＝6）Ⅰ：空白对照组；Ⅱ：模型组；Ⅲ：阳性对照组；Ⅳ：白术-木香药对低剂量组；Ⅴ：白术-木香药对中剂量组；Ⅵ：白术-木香药对高剂量组；a：与空白对照组比较，P＜0.01；b：与模型组比较，P＜0.01；c：与模型组比较，P＜0.05。3.2白术-木香药对对模型大鼠肠道敏感性和肠道推进率的影响与空白对照组比较，模型组大鼠AWR阈值显著降低，肠道推进率显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，阳性对照组和白术-木香药对中、高剂量组大鼠AWR阈值均显著升高（P＜0.05或P＜0.01），肠道推进率（白术-木香药对中剂量组除外）均显著降低（P＜0.01）。结果见图2。10.6039/j.issn.1001-0408.2024.03.07.F002图2各组大鼠AWR阈值和肠道推进率的检测结果Ⅰ：空白对照组；Ⅱ：模型组；Ⅲ：阳性对照组；Ⅳ：白术-木香药对低剂量组；Ⅴ：白术-木香药对中剂量组；Ⅵ：白术-木香药对高剂量组；a：与空白对照组比较，P＜0.01；b：与模型组比较，P＜0.01；c：与模型组比较，P＜0.05。3.3白术-木香药对对模型大鼠血清中5-HT、SP水平的影响与空白对照组比较，模型组大鼠血清中5-HT、SP水平均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，白术-木香药对各剂量组大鼠血清中5-HT、SP水平均显著降低（P＜0.01）。结果见图3。10.6039/j.issn.1001-0408.2024.03.07.F003图3各组大鼠血清中5-HT、SP水平的检测结果（x±s，n＝6）Ⅰ：空白对照组；Ⅱ：模型组；Ⅲ：白术-木香药对低剂量组；Ⅳ：白术-木香药对中剂量组；Ⅴ：白术-木香药对高剂量组；a：与空白对照组比较，P＜0.01；b：与模型组比较，P＜0.01。3.4白术-木香药对对模型大鼠结肠组织病理学形态的影响空白对照组大鼠结肠组织黏膜层、黏膜下层、肌层及浆膜层结构较完整，固有层内肠腺排列整齐，无明显变性或坏死。模型组大鼠结肠黏膜固有层坏死，肠腺结构被破坏，坏死细胞结构模糊、细胞核固缩溶解，炎症细胞浸润严重。各给药组大鼠结肠组织部分结构恢复，但仍有炎症细胞浸润和黏膜变性坏死的情况。结果见图4。10.6039/j.issn.1001-0408.2024.03.07.F004图4各组大鼠结肠组织病理学形态的观察结果（HE染色）注：红色箭头表示组织脱落，绿色箭头表示黏膜层变性坏死。3.5白术-木香药对对模型大鼠结肠组织中5-HT3R、5-HT4R、SERT蛋白表达的影响与空白对照组比较，模型组大鼠结肠组织中5-HT3R蛋白表达水平显著升高（P＜0.01），5-HT4R、SERT蛋白表达水平均显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，白术-木香药对各剂量组大鼠结肠组织中5-HT3R蛋白表达水平均显著降低（P＜0.01），5-HT4R（白术-木香药对低剂量组除外）、SERT蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05或P＜0.01）。结果见图5、表1。10.6039/j.issn.1001-0408.2024.03.07.F005图5各组大鼠结肠组织中5-HT3R、5-HT4R、SERT蛋白表达的电泳图Ⅰ：空白对照组；Ⅱ：模型组；Ⅲ：白术-木香药对低剂量组；Ⅳ：白术-木香药对中剂量组；Ⅴ：白术-木香药对高剂量组。10.6039/j.issn.1001-0408.2024.03.07.T001表1各组大鼠结肠组织中5-HT3R、5-HT4R、SERT蛋白表达水平的检测结果（x±s，n＝6）组别5-HT3R5-HT4RSERT空白对照组1.00±0.121.00±0.251.00±0.09模型组4.13±0.12a0.33±0.08a0.21±0.03a白术-木香药对低剂量组3.22±0.43b0.49±0.080.38±0.05b白术-木香药对中剂量组2.44±0.32c0.67±0.15b0.58±0.09c白术-木香药对高剂量组1.64±0.30c0.83±0.15c0.76±0.08ca：与空白对照组比较，P＜0.01；b：与模型组比较，P＜0.05；c：与模型组比较，P＜0.01。3.6白术-木香药对对模型大鼠肠道菌群与SCFAs代谢的影响在科水平上，空白对照组大鼠肠道菌群中乳酸杆菌科（Lactobacillaceae）、S24_7菌科（S24_7）、瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）和毛螺菌科（Lachnospiraceae）相对丰度分别为30.3%、17.1%、11.3%和4.3%，模型组中上述菌科相对丰度分别为33.6%、20.8%、9.8%和11.9%，白术-木香药对高剂量组中上述菌科相对丰度分别为41.5%、16.7%、5.2%和10.0%。由此可知，3组大鼠粪便均以乳酸杆菌科和S24_7菌科相对丰度较高，经白术-木香药对干预后，大鼠粪便中上述菌科相对丰度变化较大。结果见图6。10.6039/j.issn.1001-0408.2024.03.07.F006图6各组大鼠粪便中科水平排名前20的菌群分布α多样性分析结果显示，与空白对照组比较，模型组Chao1指数、observed species指数均显著升高（P＜0.05），Shannon指数、Simpson指数的差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组比较，白术-木香药对高剂量组Chao1指数、observed species指数、Shannon指数、Simpson指数均显著降低（P＜0.05）。结果见表2。10.6039/j.issn.1001-0408.2024.03.07.T002表2各组大鼠α多样性分析的结果（x±s，n＝6）组别Chao1指数observed species指数Shannon指数Simpson指数空白对照组625.61±49.50565.13±23.186.84±0.040.97±0.01模型组799.41±28.35a702.07±34.33a7.25±0.160.97±0.01白术-木香药对高剂量组632.65±114.02b560.30±109.72b6.61±0.35b0.95±0.01ba：与空白对照组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05。与空白对照组比较，模型组大鼠粪便中乙酸、丙酸、丁酸含量差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组比较，白术-木香药对高剂量组大鼠粪便中丁酸含量显著降低（P＜0.05），乙酸、丙酸含量差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表3。10.6039/j.issn.1001-0408.2024.03.07.T003表3各组大鼠粪便中SCFAs含量的检测结果（x±s，n＝6，μg/g）组别乙酸丙酸丁酸空白对照组3 561.73±791.921 143.55±241.672 914.82±937.10模型组3 018.50±322.941 156.94±190.502 902.64±584.89白术-木香药对高剂量组2 470.01±290.271 050.82±161.381 394.83±529.95aa：与模型组比较，P＜0.05。4讨论脾虚IBS-D是临床常见的肠道疾病，此类患者存在体重下降、腹泻等症状[15]。白术具有健脾益气、燥湿利水的功效，为治疗脾胃气虚证常用药[15]；木香具有行气止痛、健脾消食的功效，为治疗脾胃气滞证常用药[16]；二者联合配伍，可改善脾气虚衰、脾胃运化功能失调的情况。本研究结果发现，经白术-木香药对干预后，大鼠体重增加，腹泻缓解，精神状态恢复，肠道敏感性降低，结肠组织部分结构恢复，表明该药对可改善脾虚IBS-D模型大鼠症状。5-HT是肠功能的重要介质，在IBS中发挥特殊的作用[17]。5-HT受体中5-HT3R的主要作用是促进肠道收缩、肠液分泌和内容物运输；5-HT4R的主要作用是缓解消化不良，改善胃食管反流病、胃轻瘫或IBS[18]。SP具有调节肠道蠕动的作用，但是其异常分泌则会导致肠道平滑肌兴奋过度，引起腹泻[8]。本研究结果显示，经白术-木香药对干预后，大鼠血清中5-HT、SP水平均降低，5-HT3R蛋白表达水平降低，5-HT4R、SERT蛋白表达水平均升高。这提示，白术-木香药对可通过调节5-HT及其受体的表达，改善脾虚IBS-D模型大鼠症状。相关研究发现，焦虑IBS-D大鼠经过治疗后肠道中乳酸杆菌的数量会增加[19]。本研究结果发现，经白术-木香药对干预后，脾虚IBS-D模型大鼠肠道中乳酸杆菌相对丰度增加，且其对S24_7等拟杆菌的相对丰度具有一定调节作用，这提示白术-木香药对对脾虚IBS-D模型大鼠肠道中乳酸杆菌与拟杆菌具有特异性调节作用。Chao1数值越高反映出细菌物种越多，observed species数值越高表明细菌物种的相对丰度越高，Shannon指数和Simpson指数则是衡量细菌物种多样性的相关指标[20]。本研究结果显示，白术-木香药对可降低脾虚IBS-D模型大鼠肠道菌群的多样性与物种数量，从而减少因细菌引起的病症。除了肠道菌群的影响，其代谢产物SCFAs的变化也会影响IBS的发病过程。相关研究发现，SCFAs（主要是乙酸和丁酸）可促进5-HT的分泌和释放，诱发蠕动反射，从而增强结肠收缩，加快结肠传输速度，然后导致腹泻发生率升高[21]。本研究结果显示，经白术-木香药对干预后，脾虚IBS-D模型大鼠粪便中丁酸含量降低，但是乙酸、丙酸含量变化不大。这可能是由于肠道菌群的变化未能引起大规模SCFAs分泌异常，因此，SCFAs的变化有可能是肠道菌群与5-HT等共同作用的结果，也有可能与肠道中瘤胃球菌科和毛螺菌科相对丰度降低导致SCFAs合成减少有关。综上所述，白术与木香配伍可以改善脾虚IBS-D模型大鼠的肠道动力及肠道敏感性，并缓解腹泻，这可能与改善肠道菌群结构变化，降低5-HT表达和丁酸含量以及升高5-HT4R、SERT表达有关。