膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是常见的慢性退行性疾病，好发于中老年人群，且致残率较高。随着人口老龄化的加剧，全球症状性KOA的患病率已达3.8%，成为亟待解决的公共卫生问题之一[1]。KOA是一种全关节疾病，其发病与关节软骨及软骨周围组织的病理变化（如关节软骨破坏、软骨下骨改变和骨赘形成等）有关[2]。研究表明，滑膜病变在KOA的发病过程中具有重要作用。滑膜炎症可能是KOA的始动环节，在滑膜炎症的晚期通常伴随着滑膜纤维化（synovial fibrosis，SF）的发生，后者以胶原异常重塑、纤维结缔组织聚集和细胞外基质（extracellular matrix，ECM）沉积为主要表现，被认为是患者膝关节僵硬、功能障碍的重要原因[3]。“易层”贴敷是由全国名老中医诸方受教授在传统中医贴敷疗法的基础上，结合多年临床经验研制出的新型中医外治方法。该贴敷共有两层，第1层复方三黄油膏含黄柏、黄芩、大黄3味凉性中药，可直接敷于患者皮肤；第2层三色散则由当归、川牛膝等温经活血类中药组成，性温燥，具有活血、通络、止痛之功；两层中药相辅相成，且可根据患者寒热证型灵活调整用量，改善KOA患者的膝关节疼痛和活动受限等症状的疗效较好[4―5]。本课题组前期研究发现，“易层”贴敷不仅能够缓解KOA模型大鼠的滑膜炎症和关节疼痛，还具有抑制SF的作用，上述作用可能与该贴敷能够抑制高迁移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）表达、维持促炎-抑炎因子动态平衡有关[6]。HMGB1是一种参与炎症反应的多功能蛋白，HMGB1/Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）/核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路与炎症及纤维化的发生密切相关[7]，故本课题组推测“易层”贴敷抑制KOA患者SF的作用可能与该通路有关。基于此，本研究拟基于HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路探讨“易层”贴敷对KOA模型动物SF的干预机制，旨在为“易层”贴敷的临床应用提供依据。1材料1.1主要仪器本研究所用主要仪器包括ABI 7500型实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）仪（美国ABI公司）、170-3930型凝胶电泳及转膜仪（美国Bio-Rad公司）、LAS 4000型凝胶成像发光系统（美国GE公司）、ELX 800型酶标仪（美国BioTek公司）等。1.2主要药品与试剂“易层”贴敷由三色散（由当归、独活、川芎、秦艽、紫荆皮、马钱子、丹参、赤芍、天花粉、防风、连翘、片姜黄、羌活、蔓荆子、白芷、木瓜、川牛膝、威灵仙、防己、甘草等组方而成，苏药制字Z04000566，每贴20 g，相当于生药总量16 g）和复方三黄油膏（由黄芩、黄柏、大黄、东丹、滑石粉等组方而成，苏药制字Z04000388，每贴10 g，相当于生药总量8 g）组成，两者均由南京中医药大学附属医院/江苏省中医院提供。兔源转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗体（货号分别为3711S、19245S）均购自美国CST公司；兔源甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、HMGB1、TLR4、NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65（phosphorylated NF-κB p65，p-NF-κB p65）、金属蛋白酶组织抑制物1（tissue inhibitor of metalloproteinase 1，TIMP1）、Ⅰ型胶原蛋白（collagenⅠ）抗体（货号分别为AF7021、AF7020、AF7017、AF5006、AF2006、AF7007、AF7001）均购自美国Affinity公司；辣根过氧化物酶标记的亲和纯化山羊抗兔IgG（H+L）二抗（货号K1223）购自美国APExBIO公司；5×蛋白上样缓冲液（货号P0015L）购自上海碧云天生物技术有限公司；RNA快速提取试剂盒（货号AG21024）购自湖南艾科瑞生物工程有限公司；逆转录及PCR试剂盒（货号分别为R223-01、Q331-02）均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；无蛋白快速封闭液（货号PS108P）购自上海雅酶生物医药科技有限公司；白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）、IL-1β、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（货号分别为YJ102828、F15810、YJ002859）均购自上海源桔生物科技中心。1.3实验动物本实验选用2月龄SPF级雄性SD大鼠24只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号为SCXK（京）2021-0011。所有动物均饲养于室温（25±2）℃、相对湿度（60±5）%、每12 h昼夜交替的动物房内，自由摄食、饮水，适应性喂养1周后开始实验。本动物实验方案由南京中医药大学实验动物伦理委员会审核批准，申请号为202205A046。2方法2.1KOA模型制备与分组、给药将24只雄性SD大鼠随机分为假手术组、KOA组、易层组，每组8只。KOA组和易层组大鼠采取前交叉韧带离断法复制KOA模型：大鼠经腹腔注射30 g/L戊巴比妥钠（2 mL/kg）麻醉，于膝关节处常规备皮消毒，打开膝关节腔并切断前交叉韧带（通过前抽屉实验判断模型是否复制成功）后，逐层缝合。假手术组大鼠仅切开膝关节处皮肤后缝合。术后，每只大鼠每天肌内注射青霉素钠1次，连续3 d，以预防感染。造模14 d后，易层组大鼠于膝关节处备皮，皮肤表面先后均匀涂抹糊状的三色散（每100 cm2涂抹8 g，按成品质量计）和复方三黄油膏（每100 cm2涂抹5 g，按成品质量计），随后用纱布包裹并用胶带固定，每天贴敷8 h，连续28 d[6]；假手术组和KOA组大鼠仅于膝关节备皮处用纱布包裹。2.2组织样本的提取和保存末次给药后，所有大鼠于麻醉状态下采集腹主动脉血，血样静置1.5 h后，于4 ℃下以3 000 r/min离心15 min，取上层血清于－80 ℃下冻存，备用。于膝关节处备皮，自髌骨上缘打开关节腔，用眼科镊牵起髌骨及其周围组织并翻开，暴露髌下脂肪垫及附着在上面的滑膜，小心切取滑膜组织。随机选取每组3只大鼠的滑膜组织放入4%多聚甲醛中保存，其余5只大鼠的滑膜组织放入冻存管中于－80 ℃下保存，备用。2.3大鼠滑膜组织病理形态学观察取“2.2”项下固定于4%多聚甲醛中的各组大鼠滑膜组织，行常规石蜡包埋、切片，分别用苏木精-伊红（HE）、Masson试剂染色后，使用显微镜观察各组大鼠的滑膜炎症程度及纤维化程度。采用Krenn评分评价滑膜炎症程度，评分标准为：无炎症，记0～1分；有轻度炎症，记2～4分；有重度炎症，记5～9分[8]。2.4大鼠滑膜组织中collagenⅠ、HMGB1、p-NF-κB p65蛋白阳性表达检测采用免疫组化法检测。取“2.3”项下各组大鼠滑膜组织的石蜡切片，脱蜡至水，并进行抗原修复；以磷酸盐缓冲液（PBS）清洗5 min×3次，加入30 g/L的过氧化氢溶液适量，于室温下孵育20 min；以PBS清洗5 min×3次，以封闭液于室温下封闭30 min；弃去封闭液，滴加collagenⅠ、HMGB1、p-NF-κB p65一抗（稀释比例均为1∶100），于4 ℃下孵育过夜；以PBS清洗5 min×3次，滴加相应二抗（稀释比例1∶500），于室温下孵育60 min；以PBS清洗5 min×3次，以DAB复染细胞核，再经脱水后封片，使用Image J软件分析阳性表达细胞（呈棕色）的平均光密度值，并计算阳性表达细胞面积占比以表示上述蛋白的相对表达量。2.5大鼠血清中炎症因子含量检测取“2.2”项下各组大鼠的血清样品，严格参照相应试剂盒说明书操作，采用ELISA法以酶标仪于450 nm波长处检测其IL-1β、IL-6、TNF-α的含量。2.6大鼠滑膜组织中纤维化及HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路相关蛋白表达检测采用Western blot法检测。取“2.2”项下冻存的各组大鼠滑膜组织适量，研磨、裂解，以12 000 r/min离心15 min，取上清液。经BCA法测定浓度后，加入5×蛋白上样缓冲液适量，煮沸变性。取变性蛋白适量，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移至聚偏二氟乙烯膜上，于室温下封闭20 min；加入内参（GAPDH）、纤维化相关蛋白（TGF-β、collagenⅠ、TIMP1、α-SMA）和HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路相关蛋白（HMGB1、TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65）一抗（稀释比例均为1∶1 000），于4 ℃下孵育过夜；以TBST洗膜10 min×3次，加入相应二抗（稀释比例为1∶5 000），于室温下孵育60 min；以TBST洗膜10 min×3次，用ECL显色曝光并置于凝胶成像发光系统下成像。以GAPDH为内参，分析并计算各目的蛋白的灰度值比值，用以表示各目的蛋白的相对表达量。2.7大鼠滑膜组织中纤维化及HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路相关蛋白mRNA表达检测采用实时聚合酶链式反应（real-time PCR）法检测。取“2.2”项下冻存的各组大鼠滑膜组织适量，按照Trizol法常规提取其总RNA，逆转录后严格按照试剂盒说明书操作，进行PCR扩增。反应体系包括：上、下游引物各0.4 μL，cDNA 2 μL，2×SYBR qPCR Master Mix 10 μL，ddH2O 7.2 μL。反应包括预变性阶段（95 ℃，30 s）、循环反应阶段（95 ℃，10 s；60 ℃，30 s；共40个循环）和熔解曲线阶段（95 ℃，15 s；60 ℃，60 s；95 ℃，15 s）。以GAPDH为内参，采用2－ΔΔCt法计算各目的基因mRNA的相对表达量（结果以假手术组为参照进行归一化处理）。各目的基因的引物序列及产物大小见表1。10.6039/j.issn.1001-0408.2024.04.05.T001表1各目的基因的引物序列及产物大小目的基因序列（5′→3′）产物大小/bpGAPDH上游：GCCTTCCGTGTTCCTACC100下游：CCTGCTTCACCACCTTCTTTGF-β上游：GCAACAATTCCTGGCGTTA117下游：TTCCGTCTCCTTGGTTCAGcollagen Ⅰ上游：CGGCTCCTGCTCCTCTT117下游：AGGTTTCCACGTCTCACCATIMP1上游：CAACCCACCCACAGACA143下游：CACAGCGTCGAATCCTTTα-SMA上游：GCGTGGCTATTCCTTCGTGACTAC150下游：CCATCAGGCAGTTCGTAGCTCTTCHMGB1上游：GAGAAGCTGGCTGTAATGC155下游：GGGACAAACCACAATATAGGATLR4上游：GCCACCATTTACAGTTCGT125下游：GTCTCAGGCAGGAAAGGANF-κB p65上游：TTCCTGGGGAGAGAAGCA114下游：GGTGAGGTGGGTCTTTGG2.8统计学方法采用SPSS 25.0软件对数据进行统计分析，使用GraphPad Prism 8.0软件绘图。数据以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。3结果3.1“易层”贴敷对大鼠滑膜组织病理形态的影响HE染色结果显示，KOA组大鼠滑膜衬里细胞（以成纤维样滑膜细胞为主）大量增生且排列不规则，炎症细胞浸润明显增加；经“易层”贴敷干预后，模型大鼠的滑膜表面相对光滑，滑膜衬里细胞排列有序，炎症细胞浸润较少。Masson染色结果显示，KOA组大鼠可见大量胶原纤维沉积，提示SF发生；经“易层”贴敷干预后，易层组大鼠SF程度明显减轻。结果见图1。此外，与假手术组[（0.33±0.52）分]比较，KOA组大鼠的Krenn评分[（5.83±0.75）分]显著升高（P＜0.01）；与KOA组大鼠比较，易层组大鼠的Krenn评分[（2.50±0.84）分]显著降低（P＜0.01）。10.6039/j.issn.1001-0408.2024.04.05.F001图1各组大鼠滑膜组织病理形态学观察的显微图（HE和Masson染色法）红色箭头：炎症细胞浸润；黑色箭头：胶原纤维沉积。3.2“易层”贴敷对大鼠滑膜组织中collagenⅠ、HMGB1、p-NF-κB p65阳性表达的影响与假手术组比较，KOA组大鼠滑膜组织中collagenⅠ、HMGB1、p-NF-κB p65阳性表达细胞明显增多，其表达均显著上调（P＜0.01）；与KOA组比较，易层组大鼠滑膜组织中上述蛋白的阳性表达细胞均有所减少，其表达均显著下调（P＜0.05或P＜0.01）。结果见图2、表2。10.6039/j.issn.1001-0408.2024.04.05.F002图2各组大鼠滑膜组织中collagenⅠ、HMGB1、p-NF-κB p65蛋白阳性表达的显微图（免疫组化法）红色箭头：目的蛋白阳性表达细胞。10.6039/j.issn.1001-0408.2024.04.05.T002表2各组大鼠滑膜组织中collagenⅠ、HMGB1、p-NF-κB p65蛋白的相对表达量比较（x±s，n＝3）组别collagenⅠ/%HMGB1/%p-NF-κB p65/%假手术组4.89±0.834.15±0.3610.37±1.40KOA组18.52±0.97a12.76±0.65a16.32±0.39a易层组10.31±0.66b10.17±1.32c12.90±1.10ca：与假手术组比较，P＜0.01；b：与KOA组比较，P＜0.01；c：与KOA组比较，P＜0.05。3.3“易层”贴敷对大鼠血清炎症因子含量的影响与假手术组比较，KOA组大鼠血清中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量均显著升高（P＜0.01）；与KOA组比较，易层组大鼠血清中上述指标含量均显著降低（P＜0.01）。结果见表3。10.6039/j.issn.1001-0408.2024.04.05.T003表3各组大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量比较（x±s，n＝8，pg/mL）组别IL-1βIL-6TNF-α假手术组5.33±0.1123.90±1.1936.21±0.89KOA组12.89±0.09a41.04±0.63a87.47±0.89a易层组6.56±0.15b30.41±0.84b56.86±1.09ba：与假手术组比较，P＜0.01；b：与KOA组比较，P＜0.01。3.4“易层”贴敷对大鼠滑膜组织中纤维化相关蛋白及mRNA表达的影响与假手术组比较，KOA组大鼠滑膜组织中TGF-β、collagenⅠ、TIMP1、α-SMA蛋白及mRNA的表达均显著上调（P＜0.01）；与KOA组比较，易层组大鼠滑膜组织中上述指标的表达均显著下调（P＜0.05或P＜0.01）。结果见图3、表4。10.6039/j.issn.1001-0408.2024.04.05.F003图3各组大鼠滑膜组织中纤维化相关蛋白表达的电泳图10.6039/j.issn.1001-0408.2024.04.05.T004表4各组大鼠滑膜组织中纤维化相关蛋白及mRNA表达比较（x±s，n＝5）组别蛋白mRNATGF-βcollagenⅠTIMP1α-SMATGF-βcollagenⅠTIMP1α-SMA假手术组0.21±0.040.15±0.010.40±0.010.33±0.061111KOA组0.52±0.12a0.61±0.05a0.83±0.05a1.19±0.10a5.33±0.37a4.10±0.41a5.12±0.07a2.19±0.26a易层组0.35±0.08b0.38±0.02c0.56±0.01c0.55±0.08c1.15±0.08c1.12±0.17c1.17±0.01c1.48±0.35ba：与假手术组比较，P＜0.01；b：与KOA组比较，P＜0.05；c：与KOA组比较，P＜0.01。3.5“易层”贴敷对大鼠滑膜组织中HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路相关蛋白及mRNA表达的影响与假手术组比较，KOA组大鼠滑膜组织中HMGB1、TLR4蛋白及mRNA，p-NF-κB p65蛋白及NF-κB p65 mRNA的表达均显著上调（P＜0.01）；与KOA组比较，易层组大鼠滑膜组织中上述指标的表达均显著下调（P＜0.05或P＜0.01）。而各组大鼠滑膜组织中NF-κB p65蛋白的表达比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。结果见图4、表5。10.6039/j.issn.1001-0408.2024.04.05.F004图4各组大鼠滑膜组织中HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路相关蛋白表达的电泳图10.6039/j.issn.1001-0408.2024.04.05.T005表5各组大鼠滑膜组织中HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路相关蛋白及mRNA表达比较（x±s，n＝5）组别蛋白mRNAHMGB1TLR4NF-κB p65p-NF-κB p65HMGB1TLR4NF-κB p65假手术组0.11±0.010.40±0.030.39±0.020.55±0.07111KOA组0.68±0.11a1.42±0.24a0.38±0.191.56±0.05a2.20±0.37a4.81±0.97a3.06±0.20a易层组0.21±0.04b0.68±0.10b0.37±0.030.75±0.10b1.56±0.33c1.70±0.31b1.86±0.95ba：与假手术组比较，P＜0.01；b：与KOA组比较，P＜0.01；c：与KOA组比较，P＜0.05。4讨论KOA晚期患者膝关节滑膜通常会发生以ECM沉积、纤维结缔组织聚集等为主要特征的纤维化病变，从而引发炎症和组织损伤[9]，这也是导致患者膝关节疼痛、僵硬和功能障碍的首要原因。中医把纤维化病机归为风、寒、湿、邪侵袭所导致的经脉瘀阻、筋骨屈伸不利[10]。现代中医理论认为，温经活血类中药可针对其虚、寒、瘀的病机特点，经多靶点、多途径发挥对纤维化病变的干预作用，在各种纤维化疾病的治疗领域中表现出一定的优势[11]。“易层”贴敷作为一种新型的中医外治疗法，其方中含有当归、丹参、川牛膝等温经活血类中药，同时具有安全性高、副作用少等优点，在KOA的临床治疗方面取得了良好的效果[4，12]。研究指出，SF的发生与滑膜炎症密切相关，KOA患者大多伴有滑膜炎症，膝关节内的炎症环境较为复杂，且长期的慢性炎症可能会导致上皮间充质转化的发生，这种转化也是各种纤维化疾病的常见诱因之一[13]；此外，纤维化是机体内一种过度的修复反应，炎症环境是诱发纤维化的潜在因素之一[14]。可见，滑膜炎症的严重程度可反映SF的进展情况。本研究通过ELISA法检测了大鼠血清中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α的含量，结果显示，KOA大鼠血清中上述炎症因子的含量均较假手术组大幅增加，而易层组大鼠的上述指标含量则显著降低。HE染色结果显示，相较于假手术组，KOA组大鼠滑膜衬里细胞（以成纤维样滑膜细胞为主）增生明显且排列紊乱，炎症细胞浸润增加，Krenn评分显著升高；而易层组大鼠滑膜病变明显改善，且Krenn评分显著降低，表明“易层”贴敷可显著改善KOA大鼠的滑膜炎症。纤维化的形成与胶原蛋白表型的转换密切相关，纤维状胶原蛋白collagenⅠ的表达与纤维化的严重程度呈正相关，是经典的纤维化标志物[15]。TGF-β、TIMP1、α-SMA均为纤维化相关因子，参与调节ECM的组成和介导多种纤维化的发生[16]。本研究检测了各组大鼠滑膜组织中纤维化相关蛋白及mRNA的表达情况，结果显示，KOA组大鼠滑膜组织中纤维化相关指标TGF-β、collagenⅠ、TIMP1、α-SMA蛋白及mRNA的表达均显著上调，而易层组大鼠上述蛋白及mRNA的表达均显著下调。Masson染色结果显示，相较于假手术组，KOA组大鼠的滑膜组织存在大量的胶原纤维增生；而经“易层”贴敷干预后，大鼠的SF程度明显减轻。免疫组化结果显示，KOA组大鼠滑膜组织中collagenⅠ沉积较假手术组显著增多，而易层组大鼠上述指标得以逆转。这提示，“易层”贴敷很可能通过抑制各种炎症因子的表达而抑制纤维化的发生，从而改善KOA。HMGB1是一种参与炎症反应的多功能蛋白，在组织修复和纤维化中具有关键作用，可参与各种器官纤维化疾病的发生[17]。通常情况下，HMGB1存在于细胞核中；在感染或损伤期间，HMGB1会发生迁移，逐渐从细胞核转移至细胞质，再移动到细胞外[18]。HMGB1/TLR4/NF-κB信号转导与炎症的发生及ECM的合成密切相关：释放到细胞膜外的HMGB1与靶细胞的TLR4结合后，可激活下游NF-κB信号通路，进而诱发炎症级联反应并诱发纤维化，因此抑制HMGB1可显著减少组织炎症反应并改善纤维化[19]。本研究免疫组化结果显示，经“易层”贴敷干预后，大鼠滑膜组织中HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路相关蛋白（HMGB1、p-NF-κB p65）的表达均较KOA组显著下调；此外，Western blot、real-time PCR实验结果也显示，易层组大鼠滑膜组织中HMGB1、TLR4蛋白及mRNA，p-NF-κB p65蛋白及NF-κB p65 mRNA的表达均较KOA组显著下调，提示“易层”贴敷改善KOA大鼠SF的作用可能与其抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路的激活有关。综上所述，“易层”贴敷可改善KOA模型大鼠的SF，降低炎症及纤维化相关指标的含量/表达，抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路可能与这一作用的发挥有关。然而，本研究仅设置了“易层”贴敷单一剂量组，后续本课题组将进一步考察不同剂量的干预效果，并进一步明确“易层”贴敷对KOA SF的改善作用及机制。