非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌最普遍的组织学亚型，占所有肺癌病例的85%～90%[1]。目前，NSCLC的治疗主要以西医手段为主，包括手术、化疗、放疗、靶向治疗和免疫治疗等[2]。然而，这些治疗通常伴有复发、转移、患者预后差等不良结局，且治疗成本较高等[3]。此外，诸多靶向药物虽可延长晚期NSCLC患者的生存期，但耐药性会严重影响其长期疗效[4]。研究表明，中医药对NSCLC的辅助治疗或患者预后有促进作用，可减少不良反应的发生，并具有良好的耐受性[5]。胡黄连苷Ⅱ是中药胡黄连提取物的主要活性成分之一，具有抗氧化、抗炎和抗肿瘤等作用[6]。已有研究报道，胡黄连苷Ⅱ可抑制人肾癌ACHN细胞的增殖并促进其凋亡[7]，还可抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭[8]。这提示胡黄连苷Ⅱ具有一定的抗肿瘤活性，但其能否抑制NSCLC的恶性进展尚不明确。相关研究显示，抑制鞘氨醇激酶1（sphingosine kinase 1，SPHK1）/1-磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-phosphate，S1P）/1-磷酸鞘氨醇受体3（sphingosine-1-phosphate receptor 3，S1PR3）信号通路可抑制乳腺癌干细胞的增殖[9]，以及肺淋巴管肌瘤细胞的增殖与侵袭[10]。这提示SPHK1/S1P/S1PR3信号通路参与了肿瘤的进展，但胡黄连苷Ⅱ能否通过调节SPHK1/S1P/S1PR3信号通路来抑制NSCLC的恶性进展尚不清楚。基于此，本研究拟基于上述信号通路探究胡黄连苷Ⅱ对NSCLC恶性进展的影响及潜在机制，以期为NSCLC的治疗药物提供更多选择。1材料1.1主要仪器xMark型酶标仪、165-8001型蛋白电泳仪、Bio-Rad GelDoc XR+凝胶成像系统均购自美国Bio-Rad公司；DM2500型荧光显微镜购自德国Leica公司；E100型光学显微镜购自日本Nikon公司；SCO2W-2型细胞培养箱购自美国SHELLAB公司。1.2主要药品与试剂胡黄连苷Ⅱ对照品（批号39012-20-9，纯度≥98%）购自上海陌孚医药科技有限公司；K6PC-5对照品（SPHK1激活剂，批号SML1709，纯度≥98%）购自北京百奥创新科技有限公司；CCK-8试剂盒（批号20220703）购自北京沃比森科技有限公司；5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）染色试剂盒（批号CA1170）购自北京索莱宝科技有限公司；兔源增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）、MMP-9、SPHK1、S1PR3、胞外信号调节激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）单克隆抗体和辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG二抗（批号分别为ab92552、ab92536、ab76003、ab302714、ab248131、ab184699、ab128915、ab6721）均购自英国Abcam公司；RPMI 1640培养基（批号R10-041）购自北京毕特博生物技术有限责任公司；电化学发光试剂（批号20221226）购自北京三品医疗科技有限公司。1.3实验动物与细胞SPF级雄性BALB/c裸鼠30只，5～6周龄，体重18.5～19.5 g，购自山东艾莱克生物科技有限公司，动物生产许可证号为SCXK（鲁）2022 0007。本研究方案获得长春中医药大学实验动物伦理委员会批准，批准编号为2021309。人NSCLC细胞系A549购自中国科学院上海生科院细胞资源中心。2方法2.1细胞实验2.1.1细胞培养及胡黄连苷Ⅱ干预浓度的筛选取A549细胞，于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养。取对数生长期的A549细胞，以1×104个/孔接种于96孔板中，分别用0（对照组）、1.25、2.5、5、10、20、40、80 μmol/L的胡黄连苷Ⅱ处理24 h，并设置不含细胞、不含药物的空白组（每个浓度设置6个复孔）；随后，于每孔中加入CCK-8试剂10 μL，于37 ℃下孵育2 h，使用酶标仪于450 nm波长处检测各孔的光密度（OD）值，计算细胞存活率[细胞存活率＝（实验组OD值－空白组OD值）/（对照组OD值－空白组OD值）×100%]，并将细胞存活率接近50%时对应的胡黄连苷Ⅱ浓度作为胡黄连苷Ⅱ干预的高浓度用于后续实验。2.1.2细胞分组与处理取对数生长期的A549细胞，随机分为对照组，胡黄连苷Ⅱ低、中、高浓度组，K6PC-5组，胡黄连苷Ⅱ高浓度+K6PC-5组。各药物浓度参考“2.1.1”项下结果及相关文献[8，11]设定，具体处理过程如下：胡黄连苷Ⅱ低、中、高浓度组细胞分别用10、20、40 μmol/L的胡黄连苷Ⅱ处理24 h；K6PC-5组细胞用10 μmol/L的K6PC-5处理24 h；胡黄连苷Ⅱ高浓度+K6PC-5组细胞用40 μmol/L的胡黄连苷Ⅱ和10 μmol/L的K6PC-5共同处理24 h；对照组细胞正常培养24 h。2.1.3细胞增殖检测（1）CCK-8实验：取对数生长期的A549细胞，以2×103个/孔接种于96孔板上，按照“2.1.2”项下方法分组（每组设6个复孔）、处理。随后，于每孔中加入CCK-8试剂10 μL，于37 ℃下孵育2 h，使用酶标仪在450 nm波长处检测各孔的OD值，用以反映细胞增殖情况。（2）EdU染色实验：取对数生长期的A549细胞，以1×104个/孔接种于96孔板中，按照“2.1.2”项下方法分组（每组设6个复孔）、处理。随后，于每孔中加入50 μmol/L的EdU染液适量，染色2 h；弃去染液，细胞以4%多聚甲醛固定1 h后，以阿波罗染液染色30 min，再以4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染液染核20 min。使用荧光显微镜观察，使用Image J软件对EdU阳性细胞（呈绿色荧光）进行计数并按下式计算EdU阳性细胞率：EdU阳性细胞率＝EdU阳性细胞数/总细胞数×100%。2.1.4细胞迁移能力检测采用划痕实验检测。取对数生长期的A549细胞，以2×105个/孔接种于24孔板中，培养，待细胞铺满后，用无菌移液器枪头在板内垂直划线，用磷酸盐缓冲液清洗后，将细胞按照“2.1.2”项下方法分组（每组设6个复孔）、处理。使用光学显微镜分别于处理0、24 h时观察并测量各组细胞的划痕宽度，并按下式计算划痕愈合率：划痕愈合率＝（0 h时的划痕宽度－24 h时的划痕宽度）/0 h时的划痕宽度×100%。2.1.5细胞侵袭能力检测采用Transwell实验检测。取对数生长期的A549细胞，用不含血清的RPMI 1640培养基重悬至1×106个/mL，取上述细胞悬液100 μL置于Transwell上室，同时将含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基500 μL置于Transwell下室，培养24 h。将上层细胞按照“2.1.2”项下方法分组（每组设6个复孔）、处理。随后，去除上室底部未穿膜的细胞，将侵袭细胞（即穿膜细胞）用4%多聚甲醛固定，再以0.1%结晶紫染液染色，使用光学显微镜观察细胞侵袭情况并记录侵袭细胞数。2.1.6细胞中PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白及SPHK1/S1P/S1PR3信号通路相关蛋白表达检测采用Western blot法检测。取对数生长期的A549细胞，以2×105个/孔接种于24孔板中，按照“2.1.2”项下方法分组（每组设6个复孔）、处理。随后，收集各组细胞，裂解并提取其总蛋白。对蛋白进行定量、变性、电泳分离、转膜、封闭后，加入PCNA、MMP-2、MMP-9、SPHK1、S1PR3、ERK1/2、GAPDH一抗（稀释比例分别为1∶4 000、1∶4 000、1∶3 000、1∶3 000、1∶3 000、1∶4 000、1∶5 000），于4 ℃下孵育过夜；洗膜后，加入相应二抗（稀释比例为1∶2 000），于室温下孵育1.5 h；洗膜后，以电化学发光试剂显影，再置于凝胶成像系统下成像。使用Image J软件分析各蛋白的灰度值，以目的蛋白与内参蛋白（GAPDH）的灰度值比值作为目的蛋白的相对表达量。2.2移植瘤裸鼠实验取1×107个/mL的A549细胞悬液0.2 mL，皮下接种于BALB/c裸鼠腋窝，建立NSCLC移植瘤裸鼠模型（接种后第7天，若移植瘤长径＞5 mm，则判定造模成功[12]）。取造模成功的裸鼠30只，随机分为裸鼠-对照组，裸鼠-胡黄连苷Ⅱ低、中、高剂量组，裸鼠-K6PC-5组，裸鼠-胡黄连苷Ⅱ高剂量+K6PC-5组，每组5只。各药物剂量参考预实验结果及相关文献[8，13]设定，具体处理过程如下：裸鼠-胡黄连苷Ⅱ低、中、高剂量组裸鼠分别腹腔注射25、50、100 mg/kg的胡黄连苷Ⅱ；裸鼠-K6PC-5组裸鼠腹腔注射0.007 5 mg/kg的K6PC-5；裸鼠-胡黄连苷Ⅱ高剂量+K6PC-5组裸鼠同时腹腔注射100 mg/kg的胡黄连苷Ⅱ和0.007 5 mg/kg的K6PC-5；裸鼠-对照组裸鼠腹腔注射生理盐水。各组裸鼠均每天注射1次，持续30 d。30 d后，处死裸鼠，分离并收集其瘤体，称定瘤体质量并按下式计算瘤体体积：肿瘤体积＝0.5×a×b2（式中，a为瘤体长径，b为瘤体短径）。2.3统计学方法采用SPSS 25.0软件对数据进行统计分析。实验数据以x±s表示，多组间差异分析采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。检验水准α＝0.05。3结果3.1细胞实验结果3.1.1胡黄连苷Ⅱ干预浓度的筛选结果随着胡黄连苷Ⅱ浓度的升高，细胞存活率显著降低（P＜0.05），且有一定的浓度依赖趋势：在0、1.25、2.5、5、10、20、40、80 μmol/L胡黄连苷Ⅱ作用下，细胞存活率依次为（99.97±0.03）%、（97.78±0.12）%、（89.95±0.23）%、（80.55±0.36）%、（73.36±0.28）%、（65.57±0.23）%、（54.43±0.26）%、（43.94±0.22）%。因此，本研究选择胡黄连苷Ⅱ 40 μmol/L作为后续干预的高浓度，以10、20 μmol/L作为后续干预的低、中浓度。3.1.2胡黄连苷Ⅱ对A549细胞增殖的影响与对照组比较，胡黄连苷Ⅱ各浓度组的细胞OD450值、EdU阳性细胞率均显著降低，且呈浓度依赖性（P＜0.05）；而K6PC-5组的细胞OD450值、EdU阳性细胞率均显著升高（P＜0.05）。与胡黄连苷Ⅱ高浓度组比较，胡黄连苷Ⅱ高浓度+K6PC-5组的细胞OD450值、EdU阳性细胞率均显著升高（P＜0.05）。结果见表1、图1。10.6039/j.issn.1001-0408.2024.04.09.T001表1各组A549细胞OD450值、EdU阳性细胞率比较（x±s，n＝6）组别OD450值EdU阳性细胞率/%对照组0.92±0.0658.86±2.37胡黄连苷Ⅱ低浓度组0.83±0.07a50.69±2.15a胡黄连苷Ⅱ中浓度组0.71±0.06ab43.37±2.06ab胡黄连苷Ⅱ高浓度组0.44±0.03abc28.85±1.33abcK6PC-5组1.21±0.11a66.72±2.85a胡黄连苷Ⅱ高浓度+K6PC-5组0.75±0.06d46.65±2.17da：与对照组比较，P＜0.05；b：与胡黄连苷Ⅱ低浓度组比较，P＜0.05；c：与胡黄连苷Ⅱ中浓度组比较，P＜0.05；d：与胡黄连苷Ⅱ高浓度组比较，P＜0.05。10.6039/j.issn.1001-0408.2024.04.09.F001图1各组A549细胞增殖的EdU染色显微图3.1.3胡黄连苷Ⅱ对A549细胞迁移的影响与对照组比较，胡黄连苷Ⅱ各浓度组细胞的划痕愈合率均显著降低，且呈浓度依赖性（P＜0.05）；而K6PC-5组细胞的划痕愈合率显著升高（P＜0.05）。与胡黄连苷Ⅱ高浓度组比较，胡黄连苷Ⅱ高浓度+K6PC-5组细胞的划痕愈合率显著升高（P＜0.05）。结果见表2、图2。10.6039/j.issn.1001-0408.2024.04.09.T002表2各组A549细胞划痕愈合率变化比较（x±s，n＝6）组别划痕愈合率/%细胞侵袭数/个对照组62.23±2.9686.65±3.84胡黄连苷Ⅱ低浓度组54.43±2.68a75.86±3.16a胡黄连苷Ⅱ中浓度组45.52±2.39ab62.28±2.94ab胡黄连苷Ⅱ高浓度组29.66±1.68abc31.18±1.43abcK6PC-5组69.94±2.88a95.45±3.66a胡黄连苷Ⅱ高浓度+K6PC-5组48.87±2.35d67.73±2.88da：与对照组比较，P＜0.05；b：与胡黄连苷Ⅱ低浓度组比较，P＜0.05；c：与胡黄连苷Ⅱ中浓度组比较，P＜0.05；d：与胡黄连苷Ⅱ高浓度组比较，P＜0.05。10.6039/j.issn.1001-0408.2024.04.09.F002图2各组A549细胞迁移情况的显微图3.1.4胡黄连苷Ⅱ对A549细胞侵袭的影响与对照组比较，胡黄连苷Ⅱ各浓度组的细胞侵袭数均显著降低，且呈浓度依赖性（P＜0.05）；而K6PC-5组的细胞侵袭数显著升高（P＜0.05）。与胡黄连苷Ⅱ高浓度组比较，胡黄连苷Ⅱ高浓度+K6PC-5组的细胞侵袭数显著升高（P＜0.05）。结果见表2、图3。10.6039/j.issn.1001-0408.2024.04.09.F003图3各组A549细胞侵袭情况的显微图3.1.5胡黄连苷Ⅱ对A549细胞中相关蛋白表达的影响与对照组比较，胡黄连苷Ⅱ各浓度组细胞中PCNA、MMP-2、MMP-9、SPHK1、S1PR3、ERK1/2蛋白的相对表达量均显著降低，且呈浓度依赖性（P＜0.05）；而K6PC-5组细胞中上述蛋白的相对表达量均显著升高（P＜0.05）。与胡黄连苷Ⅱ高浓度组比较，胡黄连苷Ⅱ高浓度+K6PC-5组细胞中PCNA、MMP-2、MMP-9、SPHK1、S1PR3、ERK1/2蛋白的相对表达量均显著升高（P＜0.05）。结果见表3、图4。10.6039/j.issn.1001-0408.2024.04.09.T003表3各组A549细胞中PCNA、MMP-2、MMP-9、SPHK1、S1PR3、ERK1/2蛋白相对表达量比较（x±s，n＝6）组别PCNAMMP-2MMP-9SPHK1S1PR3ERK1/2对照组1.52±0.141.36±0.121.14±0.110.93±0.080.72±0.060.61±0.05胡黄连苷Ⅱ低浓度组1.27±0.11a1.03±0.10a0.85±0.07a0.81±0.08a0.65±0.05a0.43±0.04a胡黄连苷Ⅱ中浓度组1.01±0.08ab0.81±0.08ab0.62±0.05ab0.64±0.06ab0.51±0.04ab0.34±0.03ab胡黄连苷Ⅱ高浓度组0.63±0.05abc0.52±0.05abc0.31±0.03abc0.27±0.03abc0.30±0.03abc0.14±0.01abcK6PC-5组1.87±0.16a1.69±0.14a1.33±0.12a1.21±0.13a0.89±0.08a0.94±0.08a胡黄连苷Ⅱ高浓度+K6PC-5组1.12±0.13d0.94±0.08d0.73±0.06d0.70±0.06d0.57±0.05d0.38±0.03da：与对照组比较，P＜0.05；b：与胡黄连苷Ⅱ低浓度组比较，P＜0.05；c：与胡黄连苷Ⅱ中浓度组比较，P＜0.05；d：与胡黄连苷Ⅱ高浓度组比较，P＜0.05。10.6039/j.issn.1001-0408.2024.04.09.F004图4各组A549细胞中PCNA、MMP-2、MMP-9、SPHK1、S1PR3、ERK1/2蛋白表达的电泳图Ⅰ：对照组；Ⅱ：胡黄连苷Ⅱ低浓度组；Ⅲ：胡黄连苷Ⅱ中浓度组；Ⅳ：胡黄连苷Ⅱ高浓度组；Ⅴ：K6PC-5组；Ⅵ：胡黄连苷Ⅱ高浓度+ K6PC-5组。3.2胡黄连苷Ⅱ对裸鼠体内移植瘤生长的影响与裸鼠-对照组比较，裸鼠-胡黄连苷Ⅱ各剂量组裸鼠体内的瘤体质量均显著降低，体积均显著缩小，且均呈剂量依赖性（P＜0.05）；而裸鼠-K6PC-5组裸鼠体内的瘤体质量显著升高，体积显著增大（P＜0.05）。与裸鼠-胡黄连苷Ⅱ高剂量组比较，裸鼠-胡黄连苷Ⅱ高剂量+ K6PC-5组裸鼠体内的瘤体质量显著升高，体积显著增大（P＜0.05）。结果见图5、表4。10.6039/j.issn.1001-0408.2024.04.09.F005图5各组裸鼠体内移植瘤生长情况Ⅰ：裸鼠-对照组；Ⅱ：裸鼠-胡黄连苷Ⅱ低剂量组；Ⅲ：裸鼠-胡黄连苷Ⅱ中剂量组；Ⅳ：裸鼠-胡黄连苷Ⅱ高剂量组；Ⅴ：裸鼠-K6PC-5组；Ⅵ：裸鼠-胡黄连苷Ⅱ高剂量+K6PC-5组。10.6039/j.issn.1001-0408.2024.04.09.T004表4各组裸鼠体内肿瘤质量与体积变化比较（x±s，n＝5）组别瘤体质量/g肿瘤体积/mm3裸鼠-对照组0.76±0.06158.33±6.14裸鼠-胡黄连苷Ⅱ低剂量组0.65±0.05a135.42±5.84a裸鼠-胡黄连苷Ⅱ中剂量组0.54±0.04ab112.52±5.25ab裸鼠-胡黄连苷Ⅱ高剂量组0.23±0.02abc47.92±2.13abc裸鼠-K6PC-5组0.89±0.07a185.42±6.53a裸鼠-胡黄连苷Ⅱ高剂量+K6PC-5组0.57±0.04d118.75±5.03da：与裸鼠-对照组比较，P＜0.05；b：与裸鼠-胡黄连苷Ⅱ低剂量组比较，P＜0.05；c：与裸鼠-胡黄连苷Ⅱ中剂量组比较，P＜0.05；d：与裸鼠-胡黄连苷Ⅱ高剂量组比较，P＜0.05。4讨论胡黄连苷Ⅱ是一种糖苷类衍生物，可抑制人食管癌Eca109细胞和人结直肠癌SW480、SW620细胞的增殖、侵袭与转移[14―15]，提示该成分具有一定的抗肿瘤活性。本研究结果显示，胡黄连苷Ⅱ可浓度/剂量依赖性地抑制A549细胞的增殖、迁移、侵袭以及裸鼠体内移植瘤的生长，表明该成分能够抑制NSCLC的恶性进展。作为细胞增殖的标志蛋白，PCNA对于肿瘤细胞的DNA复制至关重要[16]；MMP-2和MMP-9可降解细胞外基质并参与肿瘤细胞的侵袭和转移，其表达水平与肿瘤细胞的侵袭、迁移能力成正比[17]。本研究检测了A549细胞中PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白的表达情况，结果显示，胡黄连苷Ⅱ可浓度依赖性地抑制细胞中PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白的表达，从蛋白水平上初步证实了胡黄连苷Ⅱ对A549细胞增殖、侵袭、迁移的抑制作用。与此同时，本研究结果还显示，胡黄连苷Ⅱ可剂量依赖性地抑制移植瘤裸鼠体内的肿瘤生长，从动物水平上初步证实了该成分对恶性肿瘤的体内抑制作用。由此可见，胡黄连苷Ⅱ有望成为NSCLC的潜在治疗药物之一。由SPHK1产生的S1P是鞘脂代谢的中心分子，S1P可与S1PR3结合，进而激活S1P下游分子ERK1/2的表达，从而调节肿瘤细胞存活、迁移等生物学过程[10，18]；另有研究证实，SPHK1/S1P/S1PR3信号通路可参与卵巢癌细胞的血管生成[19]。以上研究表明，SPHK1/S1P/S1PR3信号通路在肿瘤的恶性进展中具有重要作用。此外，SPHK1/S1P/S1PR3信号通路中S1P的活化包括其受体（S1PR）及受体活化所引起的一系列细胞反应[20]，故可通过检测SIPR3的表达来反映S1P的活性。鉴于此，本研究检测了SPHK1、S1PR3、ERK1/2蛋白的表达情况。结果显示，胡黄连苷Ⅱ可浓度依赖性地下调细胞中SPHK1、S1PR3、ERK1/2蛋白的表达，推测该成分对NSCLC恶性进展的抑制作用可能与抑制SPHK1/S1P/S1PR3信号通路有关。同时，本研究结果还显示，经SPHK1激活剂K6PC-5干预后，细胞中SPHK1/S1P/S1PR3信号通路相关蛋白SPHK1、S1PR3、ERK1/2的表达均较对照组显著升高，细胞的增殖、迁移、侵袭能力亦显著增强，裸鼠体内移植瘤的生长明显加快，表明SPHK1/S1P/S1PR3信号通路确实参与了NSCLC的恶性进展。为验证上述推测，本研究在高剂量胡黄连苷Ⅱ的基础上联合该激活剂来干预A549细胞及移植瘤裸鼠，结果显示，K6PC-5减弱了高剂量胡黄连苷Ⅱ对A549细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用以及对裸鼠移植瘤生长的抑制作用，进一步证实了胡黄连苷Ⅱ抑制NSCLC恶性进展的作用可能是通过抑制SPHK1/S1P/S1PR3信号通路来实现的。综上所述，胡黄连苷Ⅱ可能通过抑制SPHK1/S1P/S1PR3信号通路来抑制NSCLC的恶性进展。但胡黄连苷Ⅱ抑制NSCLC恶性进展还可能涉及其他机制，还有待后续研究深入探讨。