紫九牛是中国传统的瑶药之一，来源于鼠李科植物翼核果Ventilago leiocarpa Benth.的干燥根和根茎，主要分布于中国广东、广西和云南等地区。其别名为血风藤、红穿破石、铁牛入石等，始载于《广西中草药》，是一味性温、味甘的药材，属瑶医所谓的“风药”，具有补气血、强筋骨、舒筋络等功效[1]，主要用于治疗气血虚弱、月经不调、血虚经闭、风湿疼痛、跌打损伤、腰肌劳损、四肢麻木等症状。其主要活性成分有蒽醌、萘醌、黄酮及其相应的糖苷类化合物。目前已发表的关于紫九牛的质量控制研究大多是单个成分的含量测定[2―3]和指纹图谱研究[4]，对紫九牛药材的化学成分及质量控制研究相对薄弱。有研究证明，pleuropyrone A具有保肝等作用[5]，大黄素及其衍生物欧鼠李苷A、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷等蒽醌类成分也具有一定的抗炎、抗氧化和抗肿瘤等药效作用[6―9]，这可能与紫九牛的药理作用[1，10]存在一定的相关性。因此，本研究拟采用溶剂萃取法、色谱技术对上述4种成分进行分离、纯化，并测定其含量。但pleuropyrone A和欧鼠李苷A 2种成分的对照品成本较高，不易购买。一测多评（quantitative analysis of multi-components by single-marker，QAMS）法使用单一的对照品就可以同时进行多种成分的含量测定[11]。因此，本研究以大黄素为内参物，建立该成分与其他3种化学成分的相对校正因子（fi/s），采用QAMS法对紫九牛进行含量测定研究，以期达到降低实验成本、节约实验时间的目的，同时为该药材的质量控制提供参考依据。1材料1.1主要仪器本研究所用的主要仪器有e2695型高效液相色谱（HPLC）仪、2489制备型HPLC仪（美国Waters公司），1260 Infinity Ⅱ型HPLC仪（美国Agilent公司），XS-205型十万分之一电子天平（瑞士Mettler Toledo公司），KS-3200DE型液晶超声波清洗器（昆山洁力美超声仪器有限公司），ZF-2型三用紫外仪（上海安亭电子仪器厂），HH-S2型数显恒温水浴锅（江苏金怡仪器科技有限公司）。1.2主要药品与试剂实验用10批紫九牛药材分别购自广西玉林（编号S1～S6，批号依次为20221025131、20221025081、20221025101、20221025132、20221025133、20221025102）和安徽亳州（编号S7～S10，批号依次为20221025082、20221024231、20221024232、20220510111），经广西壮族自治区中医药研究院陆国寿主任药师鉴定均为鼠李科植物翼核果V. leiocarpa Benth.的干燥根茎。大黄素对照品（批号110756-201913，纯度≥98%）购自中国食品药品检定研究院；大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷对照品（批号220428，纯度≥98%）购自成都植标化纯生物技术有限公司；HPLC用甲醇、乙腈均为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。2方法与结果2.1紫九牛中4种化学成分的提取分离与结构鉴定2.1.1提取分离取紫九牛药材粗粉5 kg，加50%乙醇回流提取3次，每次1.5 h，浓缩，得浸膏。取浸膏过聚酰胺柱，依次用水和20%、40%、60%乙醇洗脱，分别浓缩，得20%乙醇洗脱物82.6 g、40%乙醇洗脱物285.4 g、60%乙醇洗脱物42.7 g。取40%乙醇洗脱物加水适量使分散混悬均匀，依次用乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取，分别得乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取部分15.6、1.87 g；取乙酸乙酯萃取部分，经硅胶层析柱分离，依次用氯仿-甲醇（100∶0→95∶5→90∶10→80∶20，V/V）洗脱，经薄层色谱检测，合并相同组分，再经反复硅胶层析柱色谱分离，得到化合物1。取40%乙醇洗脱物经水饱和正丁醇萃取后的水层部分，经硅胶层析柱分离，依次用乙酸乙酯-乙酸甲酯（80∶20→16∶5→127∶48→29∶13→69∶56→10∶10，V/V）洗脱，经薄层色谱检测，合并相同组分，再经反复硅胶层析柱色谱分离，得到化合物2、3；取水饱和正丁醇萃取后的水层部分，经硅胶柱层析分离得到的部分馏分再经制备型HPLC分离，得到化合物4。2.1.2结构鉴定根据化合物的波谱数据及薄层色谱技术，鉴定得出化合物1、2、3、4分别为大黄素、欧鼠李苷A、pleuropyrone A、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷。化合物1：黄色细针状结晶（乙酸乙酯重结晶）；可溶于NaOH稀溶液并呈红色或紫红色，加HCl稀溶液后颜色由红变黄，再次加NaOH稀溶液时颜色恢复红色；与大黄素对照品进行薄层色谱对照，发现比移值（Rf值）一致，因此鉴定化合物1为大黄素（emodin）。化合物2：黄色粉末固体。1H-NMR（500 MHz，pyridine-d5）：δ7.74（1H，s，H-7），7.66（1H，s，H-2），7.30（1H，s，H-5），7.10（1H，s，H-4），6.30（1H，s，H-1′），4.75（1H，s，H-5′），4.66（1H，d，J＝7.4 Hz，H-2′），4.40（1H，t，J＝9.1 Hz，H-4′），4.28～4.19（1H，m，H-3′），2.24（3H，s，H-15），1.62（3H，d，J＝5.8 Hz，H-6′）。13C-NMR（125 MHz，pyridine-d5）：δ191.33（C-9），181.86（C-10），165.58（C-1），164.30（C-8），163.03（C-6），149.19（C-3），136.00（C-11），133.88（C-14），124.95（C-4），121.65（C-2），114.35（C-13），111.57（C-12），110.35（C-7），109.90（C-5），100.41（C-1′），73.80（C-4′），72.65（C-2′），71.97（C-3′），71.83（C-5′），22.13（C-15），18.92（C-6′）。以上数据与文献[12]一致，因此鉴定化合物2为欧鼠李苷A（frangulin A）。经HPLC峰面积归一化法测定其纯度不低于98%，可以用作对照品。化合物3：灰褐色粉末固体。1H-NMR（500 MHz，Methyl sulfoxide-d6）：δ7.27（1H，s，H-6），6.80（1H，d，J＝2 Hz，H-9），6.77（1H，d，J＝2 Hz，H-7），6.19（1H，s，H-3），5.06（1H，d，J＝7.7 Hz，H-1′），3.73（1H，brd，J＝10.8 Hz，H-6′b），3.55（1H，dd，J＝10.8、5.4 Hz，H-6′a），3.48（1H，t，J＝8.2 Hz，H-2′），3.39（1H，m，H-5′），3.36（1H，m，H-3′），3.27（1H，t，J＝9.4 Hz，H-4′），2.74（3H，s，5-CH3），2.43（3H，s，2-CH3）。13C-NMR（125 MHz，methyl sulfoxide-d6）：δ178.59（C-4），164.01（C-2），158.98（C-8），156.24（C-10），156.05（C-1b），138.15（C-6a），134.74（C-5），124.60（C-6），116.87（C-4a），111.80（C-3），107.86（C-10a），102.77（C-7），102.38（C-9），100.65（C-1′），77.08（C-5′），76.99（C-3′），73.69（C-2′），69.42（C-4′），60.53（C-6′），22.95（5-CH3），19.15（2-CH3）。以上数据与文献[13]一致，因此鉴定化合物3为pleuropyrone A。化合物4：黄色粉末固体；可溶于NaOH稀溶液并呈红色或紫红色，加HCl稀溶液后颜色由红变黄，再次加NaOH稀溶液时颜色恢复红色；与大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷对照品进行薄层色谱对照，发现二者Rf值一致；与该对照品进行HPLC对照，发现保留时间一致。因此，鉴定化合物4为大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷（emodin-8-O-β-D-glucoside）。经HPLC峰面积归一化法测定其纯度不低于98%，可以用作对照品。2.2紫九牛中4种化学成分的含量测定2.2.1色谱条件采用Echway GowonTM C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）为流动相进行梯度洗脱（0～10 min，15%A→30%A；10～15 min，30%A；15～20 min，30%A→35%A；20～35 min，35%A→45%A；35～40 min，45%A；40～50 min，45%A→80%A；50～55 min，80%A→15%A；55～60 min，15%A）；流速为1.0 mL/min；检测波长为269 nm；进样量为10 μL；柱温为25 ℃。2.2.2混合对照品溶液的制备精密称取pleuropyrone A、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、欧鼠李苷A、大黄素对照品各适量，加入甲醇制成质量浓度分别为140.40、90.20、67.00、229.40 μg/mL的对照品储备液。分别精密量取各对照品储备液5 mL，置于同一25 mL量瓶中，加甲醇制成含pleuropyrone A、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、欧鼠李苷A、大黄素分别为28.08、18.04、13.40、45.88 μg/mL的混合对照品溶液。2.2.3供试品溶液的制备取紫九牛粉末（过60目筛）约0.2 g，精密称定，置具塞三角瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声（功率100 W，频率40 kHz）处理40 min，放至室温，再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。2.2.4专属性考察分别取上述混合对照品溶液、供试品溶液10 μL，按“2.2.1”项下色谱条件进样检测。结果显示，供试品溶液色谱图中，在与混合对照品溶液色谱图相同出峰位置有色谱峰出现，且4种成分色谱峰的峰形对称，理论板数按各目标成分色谱峰计均不低于6 000，4种成分色谱峰与相邻色谱峰的分离度均大于1.5。色谱图见图1。10.6039/j.issn.1001-0408.2024.05.09.F001图1混合对照品溶液和紫九牛供试品溶液的HPLC图1：pleuropyrone A；2：大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷；3：欧鼠李苷A；4：大黄素。2.2.5线性关系考察精密吸取“2.2.2”项下混合对照品溶液1、2、5、10、15、20 μL，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以各待测成分的进样量（X）为横坐标、对应峰面积（Y）为纵坐标建立回归方程，得到各成分的线性关系考察结果，详见表1。10.6039/j.issn.1001-0408.2024.05.09.T001表1紫九牛中4种化学成分的线性关系考察结果成分回归方程r线性范围/μgpleuropyrone AY＝3 990 420.89X－42 750.430.999 70.028 1～0.561 6大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷Y＝3 068 138.36X－21 006.970.999 60.018 0～0.360 8欧鼠李苷AY＝2 268 099.04X－13 734.120.999 60.013 4～0.268 0大黄素Y＝3 545 410.20X－89 201.430.999 60.045 9～0.917 62.2.6精密度试验精密吸取“2.2.2”项下混合对照品溶液10 μL，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果显示，pleuropyrone A、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、欧鼠李苷A、大黄素峰面积的RSD分别为1.10%、1.13%、1.21%、0.28%（n＝6），表明仪器精密度较好。2.2.7稳定性试验取紫九牛粉末（S10）0.2 g，精密称定，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，分别在室温放置0、2、4、8、12、24 h时按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果显示，pleuropyrone A、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、欧鼠李苷A、大黄素峰面积的RSD分别为1.01%、1.30%、1.29%、1.21%（n＝6），表明供试品溶液在室温下放置24 h内稳定性较好。2.2.8重复性试验取紫九牛粉末（S10）0.2 g，精密称定，按“2.2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并采用外标法（external standard method，ESM）计算样品中4种成分的含量。结果显示，pleuropyrone A、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、欧鼠李苷A、大黄素的平均含量分别为2.476、1.536、1.203、4.163 mg/g，RSD分别为1.06%、0.51%、1.02%、0.85%（n＝6），表明该方法重复性较好。2.2.9加样回收率试验取已知成分含量的紫九牛粉末（S10）6份，每份0.1 g，精密称定，分别精密加入“2.2.2”项下各对照品储备液 2 mL，按“2.2.3”项下方法制备加样回收供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，计算pleuropyrone A、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、欧鼠李苷A、大黄素的平均加样回收率，结果见表2。由表2可知，上述4种化学成分的平均加样回收率为99.41%～100.46%，RSD均不大于2.05%，表明该方法准确度较好。10.6039/j.issn.1001-0408.2024.05.09.T002表2加样回收率试验结果（n＝6）成分取样量/g样品含量/mg加入量/mg测得量/mg加样回收率/%平均加样回收率/%RSD/%pleuropyrone A0.115 40.2860.2810.56498.9399.411.640.114 20.2830.2810.566100.710.123 00.3050.2810.57897.150.110 80.2740.2810.55198.580.118 20.2920.2810.578101.780.114 60.2840.2810.56399.29大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷0.115 40.1770.1800.35397.78100.461.620.114 20.1750.1800.356100.560.123 00.1890.1800.373102.220.110 80.1700.1800.34999.440.118 20.1820.1800.364101.110.114 60.1760.1800.359101.67欧鼠李苷A0.115 40.1390.1340.276102.2499.502.050.114 20.1370.1340.27099.250.123 00.1480.1340.27997.760.110 80.1330.1340.269101.490.118 20.1420.1340.27297.010.114 60.1380.1340.27199.25大黄素0.115 40.114 20.4800.4750.4590.4590.9350.93899.13100.8799.561.800.123 00.110 80.118 20.114 60.5120.4610.4920.4770.4590.4590.4590.4590.9600.9310.9420.93397.60102.4098.0499.352.2.10fi/s的测定及影响因素考察（1）fi/s的测定。精密吸取“2.2.2”项下混合对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件分别进样1、2、5、10、15、20 μL，记录pleuropyrone A、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、欧鼠李苷A、大黄素的峰面积，以大黄素为内参物计算fi/s：fi/s＝（As/Cs）/（Ai/Ci）；式中，As为内参物峰面积，Cs为内参物质量浓度，Ai为待测成分峰面积，Ci为待测成分质量浓度。平行测定3次，计算平均值。结果显示，pleuropyrone A、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、欧鼠李苷A的fi/s平均值分别为1.147 2、0.874 7、0.644 4，RSD分别为2.15%、1.11%、0.78%（n＝3）。（2）不同仪器、色谱柱对fi/s的影响。本研究分别考察了不同仪器、不同色谱柱对fi/s的影响，实验重复3次。结果显示，分别采用Waters e2695型和Agilent 1260 Infinity Ⅱ型HPLC仪，以Agilent ZORBAX SB-C18、Waters XBridge® C18、ECHWAY GOWONTM C18为色谱柱进行检测时，pleuropyrone A的fi/s分别为1.151 3、1.126 1、1.134 4、1.163 5、1.136 5、1.134 3，平均值为1.141 0[RSD＝1.20%（n＝6）]；大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷的fi/s分别为0.892 9、0.868 5、0.875 6、0.893 4、0.871 3、0.870 5，平均值为0.878 7[RSD＝1.30%（n＝6）]；欧鼠李苷A的fi/s分别为0.629 4、0.640 1、0.633 8、0.637 4、0.645 1、0.639 8，平均值为0.637 6[RSD＝0.86%（n＝6）]。上述结果表明，不同品牌HPLC仪、不同色谱柱对fi/s的影响不大。（3）不同流速对fi/s的影响。本研究考察了流速分别为0.80、0.85、0.90、0.95、1.00、1.05 mL/min时对fi/s的影响，实验重复3次。结果显示，在上述不同流速下，pleuropyrone A的fi/s分别为1.146 5、1.148 5、1.149 0、1.146 7、1.145 9、1.141 7，平均值为1.146 4[RSD＝0.23%（n＝3）]；大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷的fi/s分别为0.880 0、0.871 2、0.878 3、0.876 7、0.876 4、0.873 7，平均值为0.876 1[RSD＝0.36%（n＝6）]；欧鼠李苷A的fi/s分别为0.649 3、0.649 7、0.648 7、0.649 5、0.646 5、0.644 4，平均值为0.648 0[RSD＝0.33%（n＝6）]。上述结果表明，流速对fi/s无显著影响。（4）不同柱温对fi/s的影响。本研究还考察了柱温分别为20、25、30、35 ℃时对fi/s的影响，实验重复3次。结果显示。在不同柱温条件下，pleuropyrone A的fi/s分别为1.137 3、1.124 0、1.127 0、1.122 0，平均值为1.127 6[RSD＝0.60%（n＝4）]；大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷的fi/s分别为0.876 8、0.865 7、0.866 0、0.864 5，平均值为0.868 3[RSD＝0.66%（n＝4）]；欧鼠李苷A的fi/s分别为0.636 9、0.638 3、0.639 5、0.631 8，平均值为0.636 6[RSD＝0.53%（n＝4）]。上述结果表明，柱温对fi/s无显著影响。2.2.11色谱峰的定位精密吸取“2.2.2”项下混合对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样检测，记录pleuropyrone A、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、欧鼠李苷A、大黄素的保留时间，以大黄素为内参物计算各成分的相对保留值（R）：R＝tRi/tRs；式中，tRi为待测成分的保留时间，tRs为内参物大黄素的保留时间。平行测定3次，取平均值。结果显示，分别采用Waters e2695型和Agilent 1260 Infinity Ⅱ型HPLC仪，以Agilent ZORBAX SB-C18、Waters XBridge® C18、ECHWAY GOWONTM C18为色谱柱进行检测时，pleuropyrone A的R分别为0.197 7、0.192 4、0.178 3、0.198 0、0.194 0、0.177 1，平均值为0.189 6[RSD＝4.99%（n＝6）]；大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷的R分别为0.339 7、0.351 6、0.319 3、0.343 2、0.355 6、0.318 9，平均值为0.338 1[RSD＝4.66%（n＝6）]；欧鼠李苷A的R分别为0.673 5、0.700 1、0.656 4、0.682 6、0.709 2、0.661 5，平均值为0.680 6[RSD＝3.08%（n＝6）]。结果表明，不同品牌HPLC仪、不同色谱柱对R的影响较小，可对色谱峰准确定位。2.2.12样品中大黄素等4种化学成分的含量测定取10批紫九牛药材样品，采用ESM对pleuropyrone A、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、欧鼠李苷A、大黄素进行含量测定，并与QAMS法计算的结果进行比较，以验证QAMS法用于紫九牛中4种成分含量测定的准确度及可靠性。平行测定3次，取平均值。结果显示，2种方法所测结果无明显差异（RSD＜3.00%，n＝3），详见表3。10.6039/j.issn.1001-0408.2024.05.09.T003表3紫九牛中4种化学成分的含量测定结果（n＝3）编号大黄素/（mg/g）pleuropyrone A大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷欧鼠李苷AQAMS法/（mg/g）ESM/（mg/g）RSD/%QAMS法/（mg/g）ESM/（mg/g）RSD/%QAMS法/（mg/g）ESM/（mg/g）RSD/%S10.4830.8460.8361.100.1580.1522.740.1850.1891.51S20.9740.6790.6661.370.3660.3581.560.1670.1622.15S30.5131.1401.1290.690.1750.1781.200.1910.1961.83S40.6120.7900.8031.150.1750.1721.220.1410.1391.01S51.4341.1611.1730.730.4830.4731.480.4170.4120.85S61.1181.1941.1741.190.4410.4360.810.2650.2691.06S73.4451.4251.4100.750.4140.4211.190.6480.6420.66S82.8411.1811.1770.240.4160.4081.370.4670.4610.91S92.9831.1561.1410.920.3980.3911.250.4060.4121.04S104.1632.4532.4760.661.5311.5360.231.2121.2030.533讨论3.1供试品溶液制备方法与色谱条件的考察本研究对供试品溶液的制备方法进行了单因素考察，包括不同提取溶剂（甲醇、50%乙醇、95%乙醇、无水乙醇）、不同提取方式（超声提取、回流提取）、不同取样量（0.2、0.5 g）、不同提取时间（20、40、60 min），最终确定了0.2 g紫九牛药材粉末用甲醇25 mL超声提取40 min的供试品溶液制备方法。本研究考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液等流动相系统，最终选择乙腈-0.1%磷酸溶液作为流动相进行梯度洗脱，此条件下所得4种化学成分色谱峰的分离度均大于1.5、峰形较好且干扰峰少。通过HPLC-光电二极管阵列检测器在210～400 nm波长范围内对4种化学成分进行全波长扫描，结果显示，在269 nm波长处的吸收较好，且各种条件均满足HPLC定量分析的要求，故选择269 nm作为最终的检测波长。3.2含量测定方法的考察为了保证紫九牛中pleuropyrone A、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、欧鼠李苷、大黄素4个定量指标的准确性，本研究首先对其线性关系及范围、精密度、重复性、稳定性、加样回收率等进行了方法学考察，在确定各指标符合要求的情况下，继续考察不同流速、柱温、色谱柱以及不同仪器对各化学成分fi/s的影响。结果发现，不同因素的改变对各化学成分fi/s的影响较小，表明该方法具有较好的耐用性。同时，本研究对4种化学成分在紫九牛药材中的存在性进行了定性分析，以确证pleuropyrone A、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、欧鼠李苷、大黄素存在于紫九牛药材中，并分别考察了在不同品牌HPLC仪、色谱柱条件下R的变化，结果显示R的变化较小；此外，本研究还对10批紫九牛药材中上述4种化学成分的色谱峰进行了定位，结果显示定位效果较好。上述内容确保了本研究中QAMS法的适用性和可行性。综上所述，本研究从瑶药紫九牛中提取分离得到了大黄素、pleuropyrone A、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、欧鼠李苷A 4种化学成分（其中后3种化学成分均为首次从该药材中分离得到），并以大黄素为内参物，采用QAMS法对紫九牛中上述4种化学成分进行了含量测定，同时与ESM所得结果进行了比较，结果显示2种方法的含量测定结果无明显差异。这表明所建立的HPLC-QAMS法稳定、可靠，可用于紫九牛中4种化学成分的含量测定和该药材的质量控制。